透皮吸收测试中如何确保皮肤样本的完整性和活性

透皮吸收测试是外用药物、化妆品有效性与安全性评价的核心环节，皮肤样本的完整性（结构未被破坏）与活性（细胞功能正常）是确保测试结果可靠的前提。若样本受损或失活，可能导致药物渗透数据偏差——如表皮屏障破坏会使药物过度渗透，细胞失活则无法反映真实代谢过程。因此，从样本获取到测试全程，需通过标准化操作精准把控细节，维持皮肤的生理状态，为透皮吸收研究提供可信的“生物载体”。

样本来源的选择与预处理规范

皮肤样本的来源直接影响其初始状态，优先选择健康供体的皮肤——人体皮肤需来自外科手术剩余（如隆胸、吸脂术），供体需无皮肤病、未长期使用激素或免疫抑制剂；动物皮肤（如猪、鼠）需选择年龄相近（如猪选6-8月龄）、无皮肤损伤的个体，因其结构与人体皮肤更接近。

预处理第一步是脱毛，需避免损伤表皮：人体皮肤若有毛发，应使用钝头剃毛刀沿毛发生长方向轻刮，禁止使用含巯基乙酸的脱毛膏（会溶解毛囊周围组织，破坏表皮屏障）；动物皮肤可选用电推剪（blade号10），每处推剪不超过2次，防止局部皮肤发热红肿。

清洗时需用37℃的磷酸盐缓冲液（PBS）或生理盐水，以浸润方式轻轻冲洗——将皮肤置于滤纸上，用注射器沿边缘缓慢注入液体，避免直接冲击表皮；若有血迹或污垢，可用蘸取PBS的纱布轻拭，切勿揉搓，防止角质层脱落。

去除皮下脂肪是关键步骤：需用钝头镊子提起脂肪层，用弯剪刀沿真皮层与脂肪层的间隙轻轻剪切，每剪一次移动0.5cm，避免划破真皮——若脂肪残留过多，会影响药物渗透；若剪切过深，可能破坏真皮乳头层的血管结构，导致样本出血、活性下降。

皮肤样本的短期保存条件

样本获取后需立即转入保存液，优先选择含1%青霉素-链霉素的DMEM培养基（含10%胎牛血清），或商用皮肤保存液（如MatTek的EpiLife®）——这类液体可维持皮肤的渗透压（约300mOsm/kg）与pH值（7.2-7.4），模拟体内环境。

保存温度需严格控制在4℃（冷藏），禁止直接冷冻——冷冻会导致细胞内形成冰晶，刺破细胞膜与细胞器，造成不可逆损伤；若需长期保存（超过48小时），需使用程序降温盒（1℃/min降至-80℃），再转入液氮，但复苏后需重新评估活性（如ATP含量需保留初始值的70%以上）。

保存时间越短越好：人体皮肤应在获取后24小时内使用，动物皮肤不超过48小时——随着时间延长，皮肤细胞会因营养耗尽而逐渐失活，如24小时后ATP含量可能下降30%，48小时后LDH释放量显著增加（提示细胞膜损伤）。

保存过程中需避免反复震荡或倒置：应将样本平放在保存容器中，液面覆盖样本1-2cm，容器密封后置于冰箱冷藏层的中层（温度最稳定），取用时需快速操作，避免样本暴露在室温下超过10分钟。

处理工具与操作的精细化控制

工具选择直接影响样本完整性：切割皮肤需使用锋利的15号手术刀片，刀刃与皮肤表面垂直，单次切割长度不超过5cm，避免拉扯导致表皮与真皮分离；转移样本需用无齿镊（尖端钝化处理），轻轻夹取皮肤边缘（约2mm处），禁止夹取中央区域（易损伤表皮细胞）。

操作手法需轻柔：将皮肤放置在硅胶垫或软木板上进行切割，避免硬质台面导致压痕；去除皮下脂肪时，需保持皮肤处于自然伸展状态（用大头针固定四角，但不要拉紧绷直），防止真皮层出现褶皱或撕裂。

避免物理损伤：测试前固定样本时，需使用低粘性胶带或专用夹具，压力控制在10-20mmHg（模拟皮肤的生理张力）——若固定过紧，会压迫真皮层血管，导致局部缺血、细胞死亡；若过松，样本可能在扩散池中移位，影响渗透面积。

工具需提前消毒：所有接触样本的工具（刀片、镊子、剪刀）需用75%乙醇浸泡30分钟，或高压灭菌（121℃，20分钟），避免微生物污染——细菌繁殖会分泌蛋白酶，分解皮肤的胶原蛋白与弹性纤维，破坏样本结构。

皮肤活性的多维度评估方法

活性评估需结合结构与功能指标：皮肤电阻抗测试是快速评估完整性的方法——使用高频电阻仪（1kHz）测量表皮电阻，健康皮肤的电阻值应≥10kΩ·cm²（角质层屏障完整），若低于5kΩ·cm²，说明表皮受损。

细胞代谢活性可通过ATP含量检测：取样本的表皮层（用胶带剥离），加入ATP提取液（如Tris-HCl缓冲液含0.1% Triton X-100），用荧光素酶法检测——ATP含量≥初始值的80%可判定为活性良好，若低于50%，说明细胞能量代谢障碍。

细胞膜完整性用LDH释放试验：将样本浸泡在不含血清的培养基中，孵育2小时后检测上清液中LDH活性——若释放率超过20%（与阳性对照相比），说明细胞膜破损，细胞内容物泄漏。

功能活性可通过葡萄糖摄取试验：用³H标记的葡萄糖溶液（1mmol/L）孵育样本1小时，测量皮肤中的放射性强度——健康皮肤的摄取量应≥0.5nmol/cm²，若低于0.2nmol/cm²，说明细胞无法正常转运营养物质，活性丧失。

常见损伤因素的提前规避策略

化学损伤是最易忽视的因素：处理样本时需避免接触有机溶剂（如乙醇、丙酮、DMSO）——即使低浓度（<5%）也会破坏表皮脂质屏障，导致角质细胞间脂质流失，增加药物渗透量；若需清洁样本，只能用PBS或生理盐水。

机械损伤需从测试系统设计入手：Franz扩散池的O型圈需选择硬度为50 Shore A的硅胶材质，安装时压力控制在5-10N——若O型圈过硬或压力过大，会压陷真皮层，形成肉眼不可见的裂纹；搅拌子的转速需设定为200-300rpm，避免产生剪切力损伤皮肤表面。

微生物污染需全程防控：保存液中需添加双抗（青霉素100U/mL、链霉素100μg/mL），操作时需在超净工作台中进行（风速≥0.5m/s），样本暴露时间不超过15分钟；若发现保存液浑浊或样本表面有斑点，需立即丢弃（提示细菌或真菌污染）。

温度波动需严格控制：测试过程中样本需维持在32℃（人体皮肤表面温度），若温度超过37℃，会加速细胞代谢，导致营养耗尽；若低于25℃，会抑制酶活性，影响药物渗透的动力学过程。

与体外测试系统的适配性调整

Franz扩散池的选择需匹配样本大小：常用的立式扩散池（如5mL接收池）适合直径2-3cm的样本，确保皮肤与池壁贴合紧密（无气泡）——若样本过大，会超出池口导致边缘暴露；若过小，会导致接收液与皮肤接触面积不足，影响渗透数据。

接收液的组成需模拟体内环境：优先选择磷酸盐缓冲液（pH7.4）或等渗生理盐水，若药物是脂溶性的，可添加2%-5%的聚乙二醇400（PEG400）以提高溶解度，但需确保PEG浓度不超过10%（否则会破坏皮肤脂质屏障）。

3D皮肤模型的使用需验证一致性：若采用人工构建的3D皮肤模型（如EpiDerm™），需确认其结构与人体皮肤一致——具有完整的角质层（10-15层角质细胞）、表皮层（含基底细胞、棘细胞、颗粒细胞），且经ATP、LDH测试验证活性稳定（与人体皮肤差异<15%）。

测试系统的密封性需检查：扩散池安装后需用石蜡油密封接口，避免水分蒸发导致样本干燥——皮肤失水超过10%（初始重量）会导致角质层收缩、裂纹形成，显著增加药物渗透量；若发现接收液体积减少超过5%，需及时补充。

测试全程的实时监测与调整

实时监测样本外观：测试前0、1、24小时观察样本的颜色（正常为淡粉色，若变为苍白或暗红，说明缺血或出血）、质地（柔软有弹性，若变硬或发脆，说明脱水或失活）、表面（无渗液、裂纹或褶皱）。

定期检测环境参数：每4小时监测一次测试室的温度（22±2℃）、湿度（40%-60%），若湿度低于40%，需用加湿器增加空气湿度，避免样本失水；若温度超过25℃，需开启空调降温，防止细胞代谢过快。

活性指标的动态跟踪：测试过程中每6小时取少量保存液，检测LDH释放率与ATP含量——若LDH释放率每小时增加超过1%，需更换保存液或调整温度；若ATP含量每6小时下降超过5%，需终止测试，更换新样本。

及时处理异常情况：若发现样本边缘出现渗液（提示真皮层损伤），需用无菌纱布轻吸，并用PBS冲洗后重新固定；若扩散池中出现气泡（影响渗透面积），需轻轻倾斜扩散池，将气泡赶出，避免挤压样本。