透皮吸收测试的国际协调会议指导原则对实验设计的要求解读

透皮吸收测试是评估贴剂、凝胶等透皮制剂有效性的核心方法，其结果直接影响制剂研发与临床应用。国际协调会议（ICH）通过《Q17 原料药开发》《M4 通用技术文档》等指导原则，针对实验设计提出系统性要求，旨在减少结果变异、确保数据可靠。本文结合ICH核心要点，从受试制剂匹配、皮肤模型选择、接受介质设计等环节，详细解读实验设计的具体要求，为透皮研发提供实操参考。

受试与参比制剂的关键属性一致性

ICH强调，受试制剂与参比制剂的核心属性必须高度一致，否则实验结果无可比性。对于透皮贴剂，需重点比对黏附性（剥离强度、持黏力）、药物释放层厚度、背衬材料透气性——这些属性直接影响皮肤接触效率与药物释放速率。例如，若受试贴剂的持黏力比参比低20%，可能在实验中脱落，导致透皮量低估。实验前需通过黏附力试验、厚度测量验证差异≤5%（部分属性可放宽至10%），并提供体外释放实验（如桨碟法）数据，证明两者释放曲线一致。

对于软膏或凝胶，一致性要求涵盖处方组成（基质类型、药物浓度）、pH值、黏度及药物粒径。药物粒径会直接影响透皮速率——粒径越小，表面积越大，渗透越快。若受试凝胶的药物粒径比参比大15%，需通过激光粒度仪重新调整，确保粒径分布一致。此外，包装材料的透气性也需匹配（如铝塑包装vs塑料包装），避免药物挥发导致含量差异。

所有一致性数据需纳入实验方案，作为“实验合理性”的支持。若受试与参比在某一关键属性上有差异，需说明差异对透皮结果的影响（如背衬材料透气性略高，但预实验证明不影响药物释放），否则实验结果可能被监管部门质疑。

皮肤模型的选择与验证标准

ICH优先推荐人皮肤（尸体或手术剩余皮肤），因其屏障功能（角质层结构）最接近人体实际。人皮肤需记录供体年龄、性别、部位（如腹部vs背部）及存储条件（-80℃冷冻≤6个月）——老年人皮肤角质层薄，透皮速率比年轻人高约30%；腹部皮肤的透皮速率比背部高20%。实验前需去除皮下脂肪（保留≤1 mm），用生理盐水冲洗，确保无残留杂质。

若人皮肤获取困难，可使用动物皮肤（如猪、兔），但需验证“透皮相关性”。方法是用标准药物（如咖啡因、水杨酸）测定动物与人皮肤的稳态通量比值，若比值在0.8-1.2范围内，说明动物皮肤可替代。例如，猪皮肤的咖啡因稳态通量为12 μg/cm²/h，人皮肤为10 μg/cm²/h，比值1.2，符合要求；兔皮肤的通量为15 μg/cm²/h，比值1.5，需更换为猪皮肤。

人工皮肤（如EpiDerm）需验证屏障功能：TEER值≥1000 Ω·cm²（与正常皮肤一致），且标准药物的透皮速率与人皮肤差异≤15%。人工皮肤的培养条件需严格遵循说明书（如37℃、5% CO₂培养14天），否则角质层未形成，透皮速率会显著升高。

无论用哪种皮肤，实验前需通过TEER或染料渗透法检查完整性——正常皮肤的TEER≥1000 Ω·cm²，若荧光素钠渗透至真皮层，说明皮肤破损，需舍弃。

接受介质的设计逻辑

接受介质需满足“生理相关”与“分析可行”的平衡。ICH要求pH值在5.5-7.4（与皮肤表面pH一致），否则会破坏角质层脂质结构。例如，弱酸性药物（如阿司匹林，pKa=3.5）在pH=5.5时以非解离型为主，更易透皮；若pH=7.4，解离型增加，透皮速率下降30%。

接受介质的溶解度需足够大，避免药物饱和。预实验需测定药物在不同介质中的溶解度（如生理盐水、含0.5%聚山梨酯80的缓冲液），选择溶解度≥“稳态通量×实验周期×体积/面积”的介质。例如，药物稳态通量10 μg/cm²/h，实验24小时，扩散面积1 cm²，接受介质10 mL，则溶解度需≥（10×24×1）/10=24 μg/mL。若生理盐水溶解度为15 μg/mL，需加增溶剂至30 μg/mL以上。

增溶剂需验证“不影响皮肤屏障”——将皮肤浸泡在含增溶剂的介质中24小时，TEER下降≤20%即为合格。同时，增溶剂不能干扰分析（如HPLC中聚山梨酯80产生峰干扰），需通过空白实验确认。

介质需脱气（超声15分钟）避免气泡附着皮肤，加0.01%叠氮化钠防止微生物生长（浓度≤0.1%，否则损伤皮肤）。

扩散池系统的参数控制

扩散池是实验核心装置，ICH对关键参数要求严格。扩散面积需校准（误差≤2%）——用游标卡尺测内径，计算面积（πr²）。例如，Franz扩散池内径1.128 cm（面积1.0 cm²），测量值1.130 cm，误差0.36%，符合要求。

搅拌速度需消除浓度梯度但不损伤皮肤，推荐200-600 rpm。预实验需验证：不同转速下透皮速率稳定的最低速度。例如，200 rpm时通量5 μg/cm²/h，400 rpm时6 μg/cm²/h，600 rpm时6.1 μg/cm²/h，选400 rpm即可。

温度需维持32±1℃（人体皮肤表面温度），过高（35℃）会增加皮肤通透性，过低（30℃）会降低。用恒温水浴锅覆盖接受介质部分，实验前用温度计校准池内温度。

装配时皮肤需平整固定，供给池（制剂侧）接触角质层，接受池（介质侧）接触真皮层，避免反向。装配后检查泄漏（如介质加染料，观察供给池是否渗色）。

实验周期与采样点的设计

实验周期需覆盖“滞后时间-上升相-稳态相”完整过程。预实验测定不同时间点的透皮量（如0.5、1、2、4、6、8、12、24小时），绘制曲线。稳态相判断标准：连续3个时间点的透皮速率变异系数≤10%。例如，8小时40 μg/cm²，12小时60 μg/cm²，16小时80 μg/cm²，斜率5 μg/cm²/h，变异系数0，即达稳态。

实验周期设为稳态时间的1.5-2倍——若稳态时间8小时，周期12-16小时；控释贴剂稳态24小时，周期36-48小时。若预实验未观察到稳态（速率持续上升），需延长周期或调整制剂（如增加药物层厚度）。

采样点需≥6个，覆盖关键阶段。滞后时间短的药物（如咖啡因，tlag=0.5小时），点设为0.5、1、2、4、6、8、12、24小时；滞后时间长的（如睾酮，tlag=2小时），设为2、4、6、8、12、24、36小时。采样体积≤介质体积10%（如10 mL介质，每次采1 mL），采后补充等量新鲜介质（预温32℃）。

重复实验与数据可靠性

皮肤个体差异是主要误差来源，ICH要求“3个平行样本+2次独立重复”。平行样本用不同供体皮肤，减少个体差异；重复实验确保结果可重复。例如，第一次用供体A、B、C，第二次用D、E、F，共6个样本，计算均值与标准差，变异系数≤20%（透皮实验可接受范围）。

若某样本透皮速率显著偏高（如均值10 μg/cm²/h，该样本20 μg/cm²/h），需检查皮肤完整性——若TEER下降60%，说明皮肤损伤，数据排除。

质量控制样本（低、中、高浓度标准品）需验证回收率90%-110%，确保分析方法准确。例如，低浓度1 μg/mL实测0.95 μg/mL（回收率95%），中浓度10 μg/mL实测10.2 μg/mL（102%），高浓度100 μg/mL实测98 μg/mL（98%），符合要求。

皮肤完整性的全程评估

实验前用TEER测定（正常皮肤≥1000 Ω·cm²），若某样本TEER=800 Ω·cm²，需更换。实验中每隔4小时检查皮肤外观，若有褶皱、破损，立即停止。实验后用荧光素钠渗透实验：浸泡皮肤30分钟，若真皮层出现荧光，说明皮肤破损，数据无效。

皮肤完整性数据需与透皮数据关联——若某样本透皮速率异常高，且TEER下降50%，说明是皮肤损伤导致，需排除该数据。