哪些标准可以指导药品透皮吸收测试的实验设计

透皮给药系统因能避免肝脏首过效应、提供稳定血药浓度、提高患者依从性，已成为药物研发的重要方向。而透皮吸收测试作为评估药物能否有效透过皮肤屏障的关键环节，其实验设计的科学性直接影响结果的可靠性与合规性。为确保测试结果符合监管要求、具备可比性，需遵循一系列国际与国内标准——这些标准从皮肤模型选择、实验装置、介质条件到数据处理均提供了明确指导，是药物研发人员设计透皮吸收实验的核心依据。

USP <1724>与<1740>：体外释放与透皮测试的技术规范

美国药典（USP）的<1724>“透皮给药系统的体外释放测试”与<1740>“透皮吸收的体外测试”是透皮实验设计的基础技术标准。其中<1724>聚焦“释放”环节，规定了三种主流测试方法：桨法（Apparatus 5）、转筒法（Apparatus 6）与往复支架法（Apparatus 7）。桨法适用于贴剂等固体剂型，要求将样品固定在桨叶下方，避免与容器壁接触；转筒法用于凝胶、乳膏等半固体，需将样品包裹在转筒表面，模拟皮肤表面的摩擦；往复支架法则针对软膏，通过支架的往复运动模拟皮肤的移动。

对于释放介质，<1724>要求需模拟皮肤的生理环境：pH值通常为5.5-7.4（接近皮肤表面pH），离子强度与人体组织液一致（约0.15M），必要时可添加0.1%-1%的表面活性剂（如聚山梨酯80）以提高难溶性药物的溶解度，但需避免破坏皮肤屏障。此外，介质需提前脱气，防止气泡附着在样品表面影响释放。

而<1740>则针对“透皮”环节，明确了体外透皮实验的核心要素：扩散池的选择（优先使用Franz垂直扩散池，因其能精确控制皮肤与介质的接触面积）、皮肤模型的要求（首选人皮肤，若使用动物皮肤需证明与人类的相关性，如大鼠皮肤的渗透率需与人类皮肤差异小于2倍）、接受介质的体积（通常为5-20ml，确保药物在介质中处于漏槽条件）。同时，<1740>要求实验温度需维持在32±1℃——这是人体皮肤表面的平均温度，能准确反映药物的透皮动力学。

USP标准的特点是“细节导向”，例如<1740>规定皮肤样本需进行完整性测试：使用电导仪测量皮肤的电阻值，若电阻低于10kΩ·cm²则表明皮肤屏障受损，需排除；此外，取样时间点需覆盖药物的释放曲线，通常设置为0.5、1、2、4、6、8、12、24小时，确保能计算出释放速率（如零级、一级动力学）。

FDA《Topical Transdermal Drug Products》：体内外相关性的核心要求

美国食品药品监督管理局（FDA）的《Topical Transdermal Drug Products: Product Development and Quality Considerations》指导原则，是透皮实验设计中“连接体外与体内”的关键依据。其核心要求是“建立体内外相关性（IVIVC）”——即通过体外透皮测试结果预测体内药物吸收情况，从而减少动物实验与人体临床试验的成本。

指导原则明确，IVIVC的建立需满足三个条件：首先，体外测试方法需具有良好的重复性（变异系数≤10%）与准确性（回收率≥90%）；其次，体外释放曲线需与体内血药浓度曲线具有线性相关性（如体外累积释放量与体内AUC呈线性）；最后，皮肤模型需与人体皮肤具有相似的屏障功能——若使用动物皮肤，需提供两者的渗透率比较数据（如兔皮肤的透皮速率与人类皮肤差异≤30%）。

此外，指导原则对皮肤的处理提出了严格要求：新鲜人皮肤需在采集后24小时内使用，若需冷冻保存，需在-20℃以下储存且保质期不超过6个月；解冻时需缓慢升温至室温（避免冰晶破坏皮肤结构）。同时，皮肤的厚度需控制在0.5-1.0mm（去除皮下脂肪后的厚度），确保角质层（透皮的主要屏障）的完整性。

FDA指导原则的另一重点是“实验设计的灵活性”——允许研发人员根据药物的特性调整实验条件（如介质的pH、搅拌速度），但需提供“调整的合理性依据”，例如若药物在酸性条件下更稳定，可将介质pH调至5.0，但需证明此pH不会影响皮肤的屏障功能。

EMA《Guideline on Quality of Transdermal Patches》：皮肤模型的验证与合规性

欧洲药品管理局（EMA）的《Guideline on Quality of Transdermal Patches》指导原则，针对透皮贴剂的质量要求，其中透皮吸收测试的核心是“皮肤模型的验证”。EMA认为，皮肤模型是透皮实验的“基石”，若模型不符合要求，所有测试结果均无效。

对于人皮肤，指导原则要求需来自健康志愿者（无皮肤疾病、未使用过局部药物），且需提供捐赠者的基本信息（如年龄、性别、皮肤部位）——因为不同部位的皮肤透皮特性差异较大（如腹部皮肤的渗透率比手掌高2-3倍）。若使用尸体皮肤，需确认死亡时间不超过24小时，且未经历过冷冻-解冻循环（否则会破坏角质层结构）。

若因伦理或成本问题无法获取人皮肤，EMA允许使用动物皮肤，但需完成“相关性验证”：首先，需测试至少3种不同药物（涵盖高、中、低渗透性）在动物皮肤与人类皮肤的渗透率，确保两者的线性相关系数（R²）≥0.9；其次，需证明动物皮肤的屏障功能与人类相似（如通过组织学检查确认角质层厚度、细胞排列一致）。例如，大鼠皮肤的角质层厚度约为15μm（人类约为20μm），若两者的渗透率差异小于20%，则可替代使用。

此外，EMA指导原则对扩散池的校准提出了严格要求：扩散池的接触面积需定期校准（每6个月一次），误差需≤2%；搅拌速度需通过转速仪验证（如设定500rpm，实际转速需在490-510rpm之间）；温度控制系统需使用热电偶校准（误差≤0.5℃）。这些校准步骤的目的是确保实验的“可重复性”——不同实验室使用相同方法能得到一致结果。

中国药典（ChP）四部：本土监管的具体要求

中国药典（2020版）四部是国内透皮吸收测试的法定标准，其中“透皮贴剂”项下的测试方法与“附录XD 释放度测定法”“附录XY 体外透皮试验法”共同构成了实验设计的依据。

附录XD规定，透皮贴剂的体外释放度测定优先使用“桨法（Apparatus 5）”，条件为：介质体积900ml，转速50rpm，温度32±1℃，取样时间点为1、2、4、6、8、12小时——这与USP <1724>一致，但增加了“释放度限度”要求：如2小时释放量≤30%，8小时释放量≥50%，24小时释放量≥80%（具体限度需根据药物特性制定）。

附录XY则针对体外透皮试验，明确了“Franz扩散池法”的操作流程：首先，将皮肤样本固定在供给室与接受室之间，确保无气泡；供给室加入药物（如贴剂的活性成分），接受室加入磷酸盐缓冲液（pH7.4）；实验过程中需持续搅拌（500rpm），并通过水浴维持温度32℃。取样时，需从接受室取出全部介质，立即补充等量新鲜介质（确保漏槽条件）。

ChP的特点是“贴合本土实际”，例如针对国内动物实验常用的“豚鼠皮肤”，附录XY明确要求需验证其与人类皮肤的相关性——因豚鼠皮肤的角质层较薄（约10μm），透皮速率可能高于人类，需通过实验调整参数（如增加皮肤厚度）以确保结果准确。此外，ChP要求实验数据需使用“加权最小二乘法”计算释放动力学参数（如释放速率常数k），避免因数据离散导致的误差。

OECD TG 428：皮肤吸收的标准化测试流程

经济合作与发展组织（OECD）的测试指南TG 428《皮肤吸收的体外测试方法》，是全球范围内皮肤吸收实验的“通用流程标准”。其核心目标是“确保不同国家、实验室的实验结果具有可比性”。

TG 428规定了实验的“七步流程”：1、皮肤的获取与制备（去除皮下脂肪，切成2.5cm×2.5cm的样本）；2、皮肤的完整性测试（电导法）；3、扩散池的组装（供给室体积2ml，接受室体积10ml）；4、药物的应用（将药物均匀涂抹在皮肤表面，面积1cm²）；5、实验条件的控制（温度32℃，搅拌速度1000rpm）；6、取样与分析（0.5、1、2、4、6、8、24小时取样，用HPLC或LC-MS测定浓度）；7、数据处理（计算累积透皮量、渗透率、滞后时间）。

其中，“药物的应用”是关键步骤：TG 428要求药物的涂抹量需模拟临床使用剂量（如贴剂的剂量为10mg/cm²，则体外实验也需使用相同剂量）；若为乳膏，需用玻璃棒均匀涂抹，避免产生气泡；若为溶液，需用移液器准确滴加，确保覆盖整个皮肤表面。

此外，TG 428对“滞后时间（Lag Time）”的计算提出了明确要求：滞后时间是药物从皮肤表面渗透到接受室的时间，反映皮肤屏障的阻碍作用。计算方法为“释放曲线的线性部分外推至横轴的交点”——若滞后时间超过2小时，需检查皮肤的完整性（可能存在破损）。

OECD标准的优势是“国际化认可”——若实验遵循TG 428，其结果可被欧盟、美国、日本等国家的监管机构接受，无需重复实验。例如，国内企业若需向欧盟申报透皮药物，使用TG 428的实验数据可直接用于注册，减少了“数据转化”的成本。

AAPS《In Vitro Release and Permeation Testing》：实验细节的优化推荐

美国药学科学家协会（AAPS）的《In Vitro Release and Permeation Testing for Transdermal Drug Products》白皮书，是透皮实验设计中“细节优化”的重要参考。其针对USP、FDA等标准未覆盖的“小问题”，提供了具体的解决方案。

例如，关于“扩散池的气泡问题”，白皮书推荐在组装扩散池时，先将接受室充满介质，再将皮肤样本覆盖在接受室上，最后缓慢加入供给室的药物——这样可避免气泡被困在皮肤与介质之间。若仍有气泡，可用注射器轻轻吸出，不可用力挤压皮肤（会破坏屏障）。

关于“取样的准确性”，白皮书要求使用“微注射器”（容量100μl）取样，避免因吸管误差导致的浓度偏差；取样后，需立即用0.22μm滤膜过滤（去除皮肤碎屑），并将样品冷藏（4℃）保存，避免药物降解。

关于“数据的统计分析”，白皮书推荐使用“方差分析（ANOVA）”比较不同批次的实验结果，若变异系数超过15%，需重新实验——因为透皮实验的重复性是关键，若同一批次的三个样本结果差异较大，说明实验条件不稳定（如温度波动、皮肤完整性不一致）。

AAPS的推荐虽然非强制性，但能显著提高实验的“成功率”——例如，通过优化气泡处理方法，可将实验的失败率从20%降低至5%；通过微注射器取样，可将浓度测定的误差从8%缩小至2%。