纳米载体递送系统在透皮吸收测试中的经皮渗透路径追踪方法

纳米载体递送系统因能提高难溶性药物透皮效率、降低皮肤刺激性，已成为透皮给药领域的研究热点。然而，其经皮渗透路径的不明确限制了系统优化——只有精准追踪载体在皮肤各层的分布、转运及代谢过程，才能针对性调整载体粒径、表面电荷等参数。因此，开发可靠的经皮渗透路径追踪方法，是纳米载体透皮系统从实验室走向临床的关键环节。

荧光标记法：可视化追踪的基础工具

荧光标记法是最常用的可视化追踪技术，核心是将荧光探针（如异硫氰酸荧光素FITC、花菁染料Cy5、量子点QDs）通过共价或非共价键连接至纳米载体表面或内部。例如，FITC可与载体材料的氨基反应形成稳定键合，而量子点因荧光强度高、抗光漂白性强，更适合长时程追踪。

透皮实验后，采用共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）或双光子显微镜（TPM）对皮肤切片进行分层扫描，通过荧光信号的位置和强度判断载体的渗透深度。某研究中，Cy5标记的聚乙二醇修饰脂质体（PEG-liposome）透皮后，CLSM图像显示：给药2小时后荧光集中在角质层（SC）的“砖-砂浆”结构间隙；6小时后穿透至颗粒层；12小时后可在真皮层检测到弱信号，提示载体主要通过细胞间路径渗透。

该方法的优势是直观、分辨率高（可达亚细胞水平），但也存在局限：荧光探针可能因降解或泄露导致假阳性；量子点的重金属成分可能干扰皮肤生理环境；光漂白效应会影响长时程观察的准确性。

放射性同位素标记法：定量分析的金标准

放射性同位素标记法以放射性核素（如³H、¹⁴C、⁹⁹mTc）作为示踪剂，通过标记载体材料或负载药物，实现定量追踪。例如，用³H标记的聚乳酸（PLA）纳米粒，或¹⁴C标记的药物分子，透皮后通过放射自显影观察放射性分布，或用液体闪烁计数器（LSC）定量检测皮肤各层的放射性活度。

某研究中，¹⁴C标记的阿霉素负载于壳聚糖纳米粒，透皮4小时后，放射自显影显示SC层放射性强度最高（占总剂量的65%），颗粒层占20%，真皮层占10%；24小时后，真皮层放射性占比升至35%，提示载体在皮肤内缓慢转运。该方法能区分载体结合药物与游离药物的分布——通过透析袋分离（截留分子量大于载体粒径），分别检测两者的放射性活度，可计算“载体包封率”和“药物释放效率”。

但放射性同位素法的缺点也很明显：辐射安全问题限制了临床应用；同位素半衰期短（如⁹⁹mTc半衰期仅6小时），需要快速实验；标记过程可能改变载体的物理化学性质（如³H标记可能降低PLA的结晶度）。

质谱成像法：无标记的多组分追踪

质谱成像（MSI）技术无需外源性标记，通过直接检测载体或药物的分子离子信号，实现空间分布的可视化。常用的MSI技术包括基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MSI）和二次离子质谱（SIMS）。

MALDI-TOF MSI的原理是：将皮肤切片均匀涂覆基质（如α-氰基-4-羟基肉桂酸），激光照射后基质吸收能量并将载体分子解吸电离，通过飞行时间质谱仪检测离子质荷比（m/z），再将信号映射到切片位置，形成“分子影像”。某研究中，采用MALDI-TOF MSI追踪聚己内酯（PCL）纳米粒的渗透路径，结果显示：载体的特征离子峰（m/z 1000-3000）主要分布在SC层的细胞间隙，6小时后向颗粒层扩散，提示载体通过细胞间脂质通道渗透。

该方法的优势是无标记、能同时检测载体和药物的分布，适合复杂体系（如负载多种药物的纳米载体）；但仪器成本高（MALDI-TOF-MS约数百万元）、样本制备复杂（需冷冻切片、基质喷涂）、检测时间长（单张切片需30-60分钟），限制了高通量应用。

拉曼光谱法：非侵入式的实时监测

拉曼光谱利用分子振动的特征拉曼位移，实现非侵入式、实时追踪。纳米载体的材料（如壳聚糖、PLGA）或表面修饰基团（如PEG）具有独特的拉曼峰：例如，壳聚糖的C-N键振动峰位于1080 cm⁻¹，PEG的C-O-C键峰位于1125 cm⁻¹。

透皮实验中，采用共聚焦拉曼显微镜（CRM）对活体皮肤或离体皮肤进行扫描，通过特征峰的位置和强度判断载体的渗透深度。某研究中，用壳聚糖纳米粒负载姜黄素，透皮后CRM检测显示：给药1小时后，1080 cm⁻¹峰（壳聚糖）出现在SC层；3小时后峰强度向颗粒层延伸；6小时后可在真皮层检测到弱信号，同时1515 cm⁻¹峰（姜黄素的芳香环振动）与壳聚糖峰空间重叠，提示药物随载体共同渗透。

该方法的优势是无标记、非侵入、可实时监测（无需切片），但拉曼信号强度弱（仅为入射光的10⁻⁶-10⁻⁸），需结合表面增强拉曼散射（SERS）技术——通过金纳米粒或银纳米粒的表面等离子体共振增强拉曼信号，检测限可降至纳摩尔级。不过，SERS纳米粒的引入可能改变载体的渗透行为，需谨慎设计实验。

电子显微镜法：超微结构的直接观察

电子显微镜（EM）技术通过电子束成像，实现纳米载体形态和位置的超微结构观察，常用的有扫描电镜（SEM）和透射电镜（TEM）。SEM用于观察载体在皮肤表面的附着情况（如纳米粒是否嵌入SC的裂隙），TEM则用于观察载体在皮肤内部的分布（如是否进入角质细胞或真皮成纤维细胞）。

某研究中，采用TEM观察聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）纳米粒的透皮路径：SC层的PMMA纳米粒（粒径100 nm）位于角质细胞间的脂质“砂浆”中，形态完整；颗粒层的纳米粒部分被角质细胞吞噬，形成吞噬体；真皮层的纳米粒则分散在细胞外基质中，提示载体通过细胞间脂质通道和角质细胞内吞两种路径渗透。

EM技术的优势是分辨率极高（TEM可达0.1 nm），能直接观察载体的形态变化（如是否降解）和细胞相互作用；但缺点是样本需经过固定、脱水、包埋等处理（如戊二醛固定、环氧树脂包埋），可能改变载体的原始状态；且无法进行实时观察，只能检测固定后的静态分布。