生物制品稳定性试验冻干过程中玻璃化转变温度测定

生物制品（如蛋白、疫苗、单克隆抗体）的稳定性是其临床有效性与安全性的核心保障，冻干技术通过低温去除水分，将生物活性成分固定在玻璃态基质中，显著降低降解风险。而玻璃化转变温度（Tg，包括冻干前浓缩液的玻璃化转变温度Tg'与冻干后产品的Tg）是冻干工艺设计与稳定性评价的关键参数——它定义了玻璃态向高弹态转变的临界温度，直接影响预冻、升华等关键步骤的参数设定，以及储存过程中产品的物理化学稳定性。因此，准确测定冻干过程中的Tg，是生物制品稳定性试验的重要环节，也是配方优化与工艺验证的核心依据。

冻干过程中玻璃化转变温度的核心意义

玻璃化转变是指非晶态材料从玻璃态（分子运动受限、硬脆）向高弹态（分子运动活跃、粘软）转变的温度点，这一转变直接决定了冻干产品的结构完整性与稳定性。冻干工艺分为预冻、升华干燥与解析干燥三个阶段：预冻需将浓缩液转化为均匀玻璃态，避免冰晶长大破坏生物活性成分；升华干燥需去除冰晶，保持玻璃态多孔结构；解析干燥需去除结合水，强化玻璃态稳定性。

其中，预冻温度需严格低于浓缩液的Tg'——若预冻温度高于Tg'，浓缩液会部分结晶，形成大冰晶，导致蛋白变性或疫苗抗原结构破坏。例如某重组人促红细胞生成素（rEPO）浓缩液的Tg'为-32℃，预冻温度需设定为-35℃以下，才能保证预冻后的玻璃态均匀；若预冻温度仅为-28℃，冰晶会长大至10μm以上，破坏rEPO的四级结构，复溶后活性丧失30%以上。

升华干燥阶段的温度则需低于冻干饼的Tg——若温度超过Tg，玻璃态会转变为高弹态，冻干饼发生“塌陷”，孔隙率下降，复溶性变差，且易吸潮。比如某流感疫苗冻干饼的Tg为-20℃，升华温度设定为-25℃时，产品孔隙率达85%，复溶时间<1min；若升华温度升至-15℃，冻干饼塌陷，孔隙率降至50%，复溶后出现不溶絮状物。

玻璃化转变温度的常用测定方法及操作要点

差示扫描量热法（DSC）是测定Tg最常用的技术，其原理是通过测量样品与参比物的热容差随温度的变化，捕捉玻璃化转变时的热容突变（表现为DSC曲线的基线偏移，拐点即为Tg）。操作中需注意以下要点：

首先是样品制备：冻干前浓缩液需超声脱气（避免气泡导致热传导不均），取2-5mg均匀液滴置于铝坩埚中；冻干后样品需研磨成100目细粉（消除多孔结构对导热的影响），同样取2-5mg密封于坩埚中——样品量过少会导致信号微弱，过多则会因导热滞后使Tg测定值偏高。

其次是测试条件：升温速率需控制在5-10℃/min——速率过快会导致热滞后，Tg偏高（如15℃/min时，某蔗糖溶液的Tg'测定值比5℃/min时高8℃）；速率过慢则耗时过长，且易受环境湿度干扰。氛围需采用氮气（流速20mL/min），防止样品氧化降解。

此外，动态力学分析（DMA）可作为补充方法：通过测量样品的储能模量（反映弹性）与损耗模量（反映粘性）随温度的变化，玻璃化转变时储能模量骤降、损耗模量出现峰值。DMA更适用于测定冻干后多孔样品的Tg（如冻干饼的力学稳定性），但操作复杂，不如DSC普及。

样品制备与前处理对测定结果的影响

冻干前浓缩液的状态直接影响Tg'的测定：若浓缩液中存在未溶解的颗粒（如赋形剂结晶），会导致DSC曲线出现杂峰，干扰Tg'的判断。例如某含甘露醇的单抗浓缩液，若甘露醇未完全溶解，DSC曲线会在-20℃出现甘露醇的结晶峰，掩盖Tg'（-35℃）的信号，需通过延长搅拌时间（30min）确保完全溶解。

冻干后样品的保存与处理至关重要：吸潮会引入水分（增塑剂），显著降低Tg——某冻干乙肝疫苗在25℃/60%RH下暴露1h，残留水分从1.2%升至2.5%，Tg从50℃降至40℃；若暴露4h，水分升至4%，Tg进一步降至30℃。因此，冻干后样品需立即密封于铝塑袋中，4℃以下保存，测定前需在干燥器中平衡30min。

研磨操作需避免过热：冻干样品的玻璃态结构脆弱，研磨时摩擦热可能导致局部温度超过Tg，引发局部塌陷。例如某冻干破伤风类毒素样品，研磨时用力过大，局部温度升至35℃（超过Tg=30℃），导致样品局部融化，DSC测定的Tg比实际值低5℃。需采用冷冻研磨（-20℃）或轻柔研磨（使用玛瑙研钵），减少热量产生。

测定过程中的常见干扰因素及排除策略

残留溶剂是最常见的干扰因素：冻干后样品中的残留水分（ICH要求<3%）或有机溶剂（如乙醇、丙酮）会降低玻璃态的稳定性，导致Tg下降。例如某含乙醇（5%）的流感疫苗浓缩液，Tg'为-40℃，若冻干后残留乙醇1%，Tg会降至-45℃。排除方法：增加解析干燥时间（从4h延长至6h）或提高解析温度（从25℃升至30℃，但需低于Tg），降低残留溶剂含量。

样品不均匀会导致DSC曲线基线波动：冻干饼内部孔隙大小不一，导热速率差异大，会使Tg测定值的RSD（相对标准偏差）超过5%（ICH要求<3%）。排除方法：将冻干饼研磨成细粉后过100目筛，取筛下物作为样品，确保颗粒大小均匀（直径<150μm）。

升温速率的波动会影响结果重复性：若同一批样品采用5℃/min与10℃/min两种速率测定，Tg'的差异可达5-8℃。需在方法验证中确认升温速率的影响（如验证5℃/min时，RSD<2%），并在测定中严格控制速率（误差±0.5℃/min）。

玻璃化转变温度与稳定性试验的直接关联

加速稳定性试验中，Tg是判断试验条件合理性的关键：ICH Q1A规定加速试验条件为40℃/75%RH，若样品的Tg低于40℃，则会发生玻璃化转变，进入高弹态，分子运动加剧，导致蛋白聚集、抗原变性。例如某单抗的Tg为35℃，加速试验40℃/75%RH下储存6个月，纯度从98%降至90%（聚集率从1%升至8%）；若调整配方（添加10%蔗糖）使Tg升至50℃，加速试验后纯度仍保持97%。

长期稳定性试验中，Tg的变化是监测样品稳定性的重要指标：若储存过程中Tg逐渐下降，说明样品吸潮或降解，玻璃态稳定性降低。例如某冻干水痘疫苗在2-8℃储存12个月，Tg从55℃降至50℃，对应残留水分从1.0%升至1.8%，提示包装密封性下降（铝塑袋的水蒸气透过率超标），需更换包装材料（如增加铝箔厚度）。

此外，Tg可指导储存条件的设定：若样品的Tg为40℃，则长期储存温度需低于Tg-20℃（即20℃以下），以确保玻璃态稳定。例如某冻干人血白蛋白的Tg为60℃，长期储存条件设定为2-8℃，远低于Tg，储存24个月后活性保持率达95%以上。

配方优化中玻璃化转变温度的应用实例

赋形剂的选择需以提高Tg为目标：蔗糖、海藻糖等二糖通过与蛋白形成氢键，强化玻璃态结构，显著提高Tg。例如某胰岛素冻干配方，无赋形剂时Tg为30℃；添加5%蔗糖后，Tg升至45℃；添加5%海藻糖后，Tg升至50℃（海藻糖的氢键结合能力更强）。但海藻糖成本较高，需平衡成本与效果。

甘露醇是常用的填充剂，但易结晶：若甘露醇用量超过10%，冻干过程中会结晶，导致玻璃态基质减少，Tg下降。例如某含15%甘露醇的疫苗配方，冻干后甘露醇结晶率达30%，Tg从45℃降至35℃。需采用甘露醇与蔗糖复配（如8%甘露醇+2%蔗糖），既避免结晶，又提高Tg（复配后Tg为48℃）。

pH值会影响浓缩液的Tg'：蛋白在等电点（pI）附近时，分子间静电排斥最小，聚集程度低，Tg'较高。例如某单抗的pI为8.5，pH7.0时Tg'为-35℃；pH8.0时Tg'升至-30℃；pH8.5时Tg'达-28℃。因此，配方pH设定为8.0（接近pI），可提高Tg'，降低预冻温度的要求（从-40℃降至-35℃），减少能耗。