外用溶液剂透皮吸收测试的渗透压调节对皮肤细胞活力的影响

外用溶液剂是经皮给药系统的重要剂型，其透皮吸收效率直接关系到药效发挥，而透皮吸收测试是评估该类制剂有效性与安全性的核心环节。在测试中，溶液的渗透压作为基本理化性质，常因关注药物浓度、pH等因素被忽视，但其对皮肤细胞活力的影响会直接干扰测试结果的准确性——过高或过低的渗透压会导致皮肤细胞（如角质形成细胞、成纤维细胞）发生容积变化、代谢紊乱甚至凋亡，进而破坏皮肤屏障功能，使药物穿透量异常升高或降低，误导对制剂透皮能力的判断。因此，明确渗透压调节与皮肤细胞活力的关系，是优化透皮吸收测试方法、确保结果可靠性的关键。

外用溶液剂透皮吸收测试中渗透压的基础角色

外用溶液剂的透皮吸收测试主要通过模拟体内环境，评估药物穿透皮肤角质层、进入表皮与真皮的速率及累积量，其结果是制剂临床有效性的重要依据。在这一过程中，溶液的渗透压并非“无关参数”——皮肤作为半透膜结构，其屏障功能依赖于表皮角质层的脂质排列与细胞间连接，而渗透压变化会直接影响皮肤细胞的生理状态：当溶液渗透压与皮肤细胞内渗透压失衡时，细胞会通过吸水或失水调整容积，这一过程不仅会破坏细胞的形态结构，还会干扰细胞的代谢活动（如ATP生成、蛋白合成），最终导致细胞活力下降。

更关键的是，皮肤细胞活力的降低会间接影响药物的透皮效率：例如，若溶液高渗导致角质形成细胞凋亡，表皮的紧密连接会被破坏，药物无需通过正常的透皮路径（如细胞间隙扩散、脂质通道渗透）即可快速穿透，使测试得到的“药物吸收量”远高于实际体内情况；反之，低渗导致细胞肿胀破裂，皮肤屏障的完整性丧失，同样会让药物穿透量异常升高。因此，渗透压调节的核心目标并非单纯“匹配血浆渗透压”，而是维持皮肤细胞的正常活力，确保透皮吸收测试的结果能真实反映制剂的固有特性。

在实际测试中，常用的皮肤模型（如人离体皮肤、HaCaT细胞构建的表皮模型、3D全层皮肤模型）均对渗透压变化敏感。例如，人离体皮肤的角质层在高渗溶液中会因失水而收缩，导致脂质双分子层的排列紊乱，使皮肤的通透系数（Papp）增加2-3倍；而3D皮肤模型中的成纤维细胞若暴露于低渗溶液，会因肿胀导致真皮层的胶原纤维断裂，进一步破坏皮肤的机械屏障。这些变化均源于细胞活力的下降，而非药物本身的透皮能力，因此若忽视渗透压调节，测试结果的可靠性将大打折扣。

皮肤细胞对渗透压变化的生物学敏感机制

皮肤的主要功能细胞（角质形成细胞、成纤维细胞、朗格汉斯细胞）均具备完善的渗透压感知与调节系统，以应对外界环境的渗透压变化。其中，角质形成细胞（表皮的主要细胞类型）表达大量水通道蛋白3（AQP3），该蛋白负责细胞内与细胞外的水、甘油运输，是维持表皮水化状态的关键；当成纤维细胞（真皮的主要细胞）面临渗透压变化时，会激活容积调节性阴离子通道（VRAC），通过氯离子外流调整细胞容积，避免肿胀或皱缩。

当外界溶液渗透压高于细胞内渗透压（高渗）时，细胞会迅速失水皱缩，此时AQP3的表达会下调以减少水分流失，但持续的高渗会导致细胞内渗透压无法恢复——例如，HaCaT细胞在350mOsm/kg的氯化钠溶液中培养6小时，AQP3的mRNA水平会下降40%，进而影响细胞的水化能力与代谢效率。对于成纤维细胞，高渗会激活VRAC通道，导致细胞内氯离子浓度降低，破坏离子平衡，进而抑制线粒体的呼吸链功能，使ATP生成减少25%-30%，最终导致细胞活力下降。

低渗环境下的细胞反应则更为剧烈：当溶液渗透压低于细胞内渗透压时，水分会大量进入细胞，导致细胞肿胀。此时，角质形成细胞的紧密连接蛋白（如Claudin-1、Occludin）会因细胞形态改变而发生分布紊乱，原本紧密排列的蛋白分子分散在细胞膜上，使表皮的屏障功能丧失；成纤维细胞则会因肿胀激活钙通道，导致细胞内钙离子浓度升高（即“钙超载”），这一变化会破坏线粒体的膜电位，引发氧化应激反应（如ROS生成增加），最终导致细胞坏死。

朗格汉斯细胞作为皮肤的免疫细胞，对渗透压变化的敏感度更高。高渗或低渗溶液均会导致其细胞骨架（微丝、微管）的聚合状态改变——例如，300mOsm/kg以上的高渗溶液会使朗格汉斯细胞的微管蛋白解聚，导致细胞无法迁移至淋巴结传递抗原信号；而低渗溶液会让微丝过度聚合，使细胞形态变得不规则。这些变化不仅影响皮肤的免疫功能，还会因朗格汉斯细胞的数量减少或功能下降，让药物更容易穿透皮肤，干扰测试结果的准确性。

高渗溶液对皮肤细胞活力的具体影响

高渗溶液通常指渗透压高于血浆渗透压（>310mOsm/kg）的溶液，常见于外用制剂中过量添加氯化钠、丙二醇、甘露醇等渗透压调节剂的情况。高渗对皮肤细胞的损伤主要表现为细胞脱水皱缩、凋亡增加及功能抑制。

对表皮角质形成细胞而言，高渗会激活细胞内的凋亡通路：研究发现，用350mOsm/kg的氯化钠溶液处理HaCaT细胞24小时后，细胞内的caspase-3活性升高3倍，凋亡率从正常组的5%升至25%。这是因为高渗会导致细胞内的氧化应激水平升高（ROS生成增加），进而激活线粒体凋亡途径——线粒体膜电位下降，细胞色素C释放进入细胞质，最终启动caspase级联反应。

对真皮成纤维细胞，高渗的主要影响是抑制其合成功能：成纤维细胞负责分泌胶原蛋白与弹性蛋白，维持皮肤的结构支撑，而高渗会下调转化生长因子β1（TGF-β1）的表达——TGF-β1是促进胶原合成的关键细胞因子，其表达量下降会导致胶原I型蛋白的分泌量减少40%以上。此外，高渗还会抑制成纤维细胞的增殖能力：用320mOsm/kg的丙二醇溶液处理人真皮成纤维细胞（HDF）48小时，细胞的增殖率从80%降至50%，因为高渗抑制了细胞周期中的G1/S期转换。

对朗格汉斯细胞，高渗会破坏其免疫功能：朗格汉斯细胞的迁移能力依赖于细胞骨架的动态重组，而高渗会导致其微丝蛋白（如肌动蛋白）的磷酸化水平降低，使细胞无法形成伪足，迁移速率下降60%。这一变化会让皮肤的免疫监视功能减弱，药物穿透皮肤时无需面对免疫细胞的“拦截”，导致测试中的药物累积量异常升高，但这并非制剂透皮能力的真实体现。

低渗溶液对皮肤细胞活力的潜在危害

低渗溶液指渗透压低于血浆渗透压（<280mOsm/kg）的溶液，常见于制剂稀释过度、未添加渗透压调节剂的情况（如蒸馏水作为溶剂的溶液）。低渗对皮肤细胞的损伤以细胞肿胀、细胞膜破裂及屏障功能丧失为主。

表皮角质形成细胞对低渗的反应最为迅速：当细胞处于低渗环境时，水分会大量涌入细胞，导致细胞体积膨胀至正常的1.5倍以上。若渗透压失衡持续存在，细胞膜的张力会超过其承受极限，最终破裂——用250mOsm/kg的葡萄糖溶液处理HaCaT细胞12小时后，细胞的乳酸脱氢酶（LDH）释放量增加3倍（LDH是细胞内酶，其释放量直接反映细胞膜的完整性）。此外，低渗还会破坏角质形成细胞的紧密连接：Claudin-1与Occludin是构成紧密连接的关键蛋白，低渗会导致其在细胞膜上的分布从“连续带状”变为“分散点状”，使表皮的通透系数增加2倍以上。

对真皮成纤维细胞，低渗的主要危害是导致细胞坏死：低渗会激活细胞内的钙通道，使细胞外钙离子内流，导致细胞内钙离子浓度升高至正常的4倍（即“钙超载”）。钙超载会破坏线粒体的功能——线粒体膜电位下降，ATP生成减少，同时激活磷脂酶A2，导致细胞膜的磷脂分解，最终引发细胞坏死。用260mOsm/kg的溶液处理HDF细胞24小时，细胞的坏死率从正常组的3%升至18%。

低渗对透皮吸收测试的干扰同样显著：例如，用低渗布洛芬溶液（250mOsm/kg）测试3D皮肤模型的透皮量，结果显示药物累积量比等渗组（290mOsm/kg）高40%，但进一步检测发现，低渗组的皮肤模型中，角质形成细胞的活力仅为等渗组的70%，说明药物吸收量的增加是因皮肤屏障破坏，而非药物本身的透皮能力提升。

渗透压调节中的等渗范围与皮肤细胞相容性

通常认为，等渗溶液的渗透压应与血浆渗透压（280-310mOsm/kg）一致，但皮肤的实际渗透压环境与血浆不同——正常皮肤角质层的渗透压约为250-290mOsm/kg（因角质层的水化程度而异），表皮细胞内的渗透压约为270-300mOsm/kg，真皮细胞内的渗透压约为280-310mOsm/kg。因此，外用溶液的“最佳渗透压范围”并非严格匹配血浆，而是应接近皮肤细胞的内渗透压，即260-320mOsm/kg。

这一范围的合理性已被多项研究验证：用270-300mOsm/kg的溶液处理HaCaT细胞与HDF细胞24小时，细胞活力均保持在90%以上；当渗透压超过320mOsm/kg或低于260mOsm/kg时，细胞活力会逐渐下降——330mOsm/kg组的细胞活力降至85%，250mOsm/kg组降至80%，340mOsm/kg或240mOsm/kg组则降至70%以下。

此外，渗透压调节剂的选择也会影响细胞相容性。常用的调节剂包括氯化钠、甘油、甘露醇、丙二醇等，其中甘油与皮肤细胞的相容性最佳：甘油不仅能调节渗透压，还能通过AQP3进入角质形成细胞，增加细胞内的甘油含量，提升细胞的水化程度，缓解高渗或低渗带来的损伤。例如，用10%甘油调节渗透压至300mOsm/kg的溶液，处理HaCaT细胞24小时后，细胞活力为95%，而用1%氯化钠调节至相同渗透压的溶液，细胞活力为90%。

相比之下，氯化钠的相容性较差：高浓度氯化钠会导致细胞内的氯离子浓度升高，干扰细胞的离子平衡，进而影响线粒体的功能。因此，在调节渗透压时，优先选择甘油、甘露醇等“生理性调节剂”，或采用混合调节剂（如氯化钠+甘油），以减少单一调节剂的副作用。

透皮吸收测试中渗透压的控制与验证方法

在透皮吸收测试中，渗透压的控制需贯穿制剂研发的全过程：首先，在处方设计阶段，应通过理论计算（如根据药物与辅料的渗透压贡献值）初步确定调节剂的用量，再通过实验验证（如冰点降低法测渗透压）调整至目标范围；其次，在测试前，需对每一批次的溶液进行渗透压检测，确保其波动不超过±10mOsm/kg（如目标渗透压为300mOsm/kg，则实际值应在290-310mOsm/kg之间）。

常用的渗透压检测方法是冰点降低法：该方法利用溶液的冰点随渗透压升高而降低的原理，通过测量溶液的冰点下降值计算渗透压（公式：渗透压=冰点下降值/1.86）。这种方法的优点是准确、快速，适用于各种外用溶液剂（包括含蛋白质、多糖等大分子辅料的溶液）。

除了检测渗透压，还需验证溶液对皮肤细胞活力的影响：常用的方法包括MTT法（检测细胞代谢活力）、CCK-8法（检测细胞增殖活力）、LDH释放法（检测细胞膜完整性）。例如，在测试某外用维生素C溶液的透皮吸收前，需用该溶液处理HaCaT细胞24小时，若MTT法测得的细胞活力≥90%，则说明渗透压调节符合要求；若活力<90%，则需调整调节剂用量，重新检测。

此外，在选择皮肤模型时，需考虑模型对渗透压的敏感程度：例如，3D全层皮肤模型（包含表皮与真皮）比单一的HaCaT细胞模型更接近体内环境，其对渗透压变化的反应更真实；而人离体皮肤模型因保留了完整的角质层与真皮结构，是验证渗透压影响的“金标准”。例如，用3D皮肤模型测试不同渗透压的溶液，若高渗组的药物穿透量是等渗组的2倍，但细胞活力仅为等渗组的70%，则说明高渗导致了皮肤屏障破坏，需调整渗透压。

不同皮肤细胞类型对渗透压变化的反应差异

皮肤由表皮、真皮与皮下组织构成，不同层次的细胞对渗透压变化的敏感度与反应机制存在显著差异，这是渗透压调节中需重点考虑的因素。

表皮角质形成细胞的耐受力最强：角质形成细胞在分化过程中会合成大量角蛋白，形成坚韧的细胞骨架，能在一定程度上抵抗渗透压变化带来的容积改变。例如，用340mOsm/kg的溶液处理HaCaT细胞24小时，细胞活力仍能保持在75%；而相同渗透压的溶液处理HDF细胞（真皮成纤维细胞），活力仅为60%——成纤维细胞是间质细胞，缺乏角蛋白保护，更容易因渗透压变化受损。

真皮成纤维细胞对低渗更敏感：成纤维细胞的细胞膜较薄，细胞内水分含量高（约占80%），低渗环境下更容易肿胀破裂。例如，用250mOsm/kg的溶液处理HDF细胞12小时，LDH释放量增加4倍，而HaCaT细胞仅增加2倍。

朗格汉斯细胞对渗透压变化的敏感度最高：朗格汉斯细胞是免疫细胞，代谢率高，对环境变化适应能力弱。例如，用310mOsm/kg（略高渗）的溶液处理朗格汉斯细胞24小时，活力降至80%；用270mOsm/kg（略低渗）的溶液处理，活力降至75%。这种高敏感性会导致朗格汉斯细胞迁移能力下降，使药物穿透量异常升高，干扰测试结果。

实际应用中外用溶液渗透压调节的注意事项

在实际的外用溶液剂研发中，渗透压调节需与其他理化性质（如pH、药物溶解度、稳定性）综合考虑，避免因单一参数优化而导致整体性能下降。

首先，需考虑药物本身的渗透压贡献：许多药物（如维生素C、水杨酸）本身具有渗透压，例如1%维生素C溶液约50mOsm/kg，设计处方时需将其计入总渗透压，避免调节剂过量。

其次，需注意溶剂的影响：溶剂（如丙二醇、乙醇）会贡献渗透压，例如10%丙二醇约100mOsm/kg，需减少调节剂用量以维持目标渗透压。

第三，需避免pH与渗透压的协同损伤：皮肤最佳pH为5.0-5.5（酸性保护罩），若溶液pH<5.0，会破坏角质层脂质结构，使皮肤对渗透压更敏感。例如，pH4.0+350mOsm/kg的溶液处理HaCaT细胞，活力仅50%；而pH5.5+350mOsm/kg的组仍有70%活力，因此需将pH控制在5.0-5.5之间。

最后，需考虑制剂稳定性：有些调节剂（如甘露醇）会影响药物稳定性，例如甘露醇与维生素C混合会加速氧化降解，因此需进行稳定性研究（如加速试验），确保调节剂不影响药物含量与纯度。