水体检测中微生物检测用培养基的制备与质量控制要求

水体微生物检测是保障水质安全的核心环节，而培养基作为微生物生长的“营养基质”，其制备精度与质量稳定性直接决定检测结果的可信度。从饮用水的总大肠菌群筛查到工业废水的微生物污染评估，培养基的配方准确性、灭菌有效性及性能一致性都是“检测链条的基石”。本文围绕水体检测中微生物培养基的制备流程与质量控制要点展开，为实验室标准化操作提供可落地的指引。

水体检测常用微生物培养基的类型与配方依据

水体检测中，微生物培养基的选择需匹配目标菌的生理特性与检测目的。常用类型包括：营养琼脂（用于总大肠菌群、细菌总数的初筛）、伊红美蓝琼脂（EMB，用于大肠菌群的鉴别与计数）、SS琼脂（用于沙门氏菌、志贺氏菌的分离）、虎红琼脂（用于霉菌与酵母菌的计数）。这些培养基的配方均依据国标GB/T 5750《生活饮用水标准检验方法》或行标HJ/T 347《水质 粪大肠菌群的测定 多管发酵法》制定，确保方法的统一性。

以营养琼脂为例，其核心成分包括蛋白胨（10g/L，提供氮源与生长因子）、牛肉膏（3g/L，补充碳源与维生素）、琼脂（15g/L，凝固剂）、氯化钠（5g/L，维持渗透压），pH值7.2±0.2。EMB琼脂则在营养琼脂基础上添加伊红（0.4g/L）、美蓝（0.065g/L）作为指示剂，大肠埃希氏菌分解乳糖产酸，会使菌落呈现紫黑色并带金属光泽，而沙门氏菌等不发酵乳糖的菌株则形成无色透明菌落，实现选择性鉴别。

SS琼脂的选择性更强，通过添加胆盐（8.5g/L）、枸橼酸钠（8.5g/L）抑制革兰氏阳性菌与部分大肠菌群，同时以乳糖（10g/L）作为发酵底物，中性红（0.025g/L）作为pH指示剂，沙门氏菌、志贺氏菌因不发酵乳糖，菌落呈无色或淡黄色，而大肠菌群则形成红色菌落，便于分离。

培养基原料的选择与预处理要求

原料质量是培养基性能的基础，需严格遵循“微生物学级”标准：蛋白胨应选择胰蛋白胨或大豆蛋白胨，不含抗生素、防腐剂等抑制成分，溶解度高且氮含量稳定（≥12%）；琼脂需选强度≥1200g/cm²的优质琼脂条，加热后透明无沉淀，避免因凝固力不足导致平板软化；氯化钠需用分析纯，无重金属污染；指示剂（如伊红、美蓝）需为生物染色剂，纯度≥98%。

水的选择直接影响培养基的无菌性与pH稳定性，需使用无微生物污染的纯水（如超纯水或双蒸水），电导率≤1.0μS/cm，避免自来水中的氯、重金属或微生物干扰。预处理时，原料称量需用精度0.1g的电子天平，称量前需校准天平，避免误差；易结块的原料（如蛋白胨、琼脂）需先在干燥器中平衡水分，再分散于冷纯水中，防止溶解时结块。

溶解前的原料混合需遵循“先难后易”原则：先将蛋白胨、牛肉膏等水溶性差的成分加入冷纯水，搅拌至分散，再加入氯化钠、指示剂等易溶成分；琼脂需最后加入，避免因提前凝固导致溶解不完全。例如，制备营养琼脂时，先取900ml纯水，加入蛋白胨、牛肉膏搅拌5分钟，再加入氯化钠，加热至40℃后加入琼脂，继续加热至沸腾。

培养基的溶解与分装操作规范

溶解过程需控制温度与时间：营养琼脂、EMB琼脂等非含糖培养基需煮沸1-2分钟，直至溶液完全透明（无肉眼可见颗粒）；含糖培养基（如虎红琼脂、麦芽糖琼脂）需用“低温溶解法”——先将糖溶于冷纯水，再加入其他成分，加热至80℃保持5分钟，避免糖碳化破坏营养。溶解时需用玻璃棒持续搅拌，防止局部过热导致蛋白变性。

分装需在无菌环境（超净工作台或无菌室）中进行，容器选择耐热、耐高压的玻璃或聚丙烯制品（如18mm×180mm试管、500ml锥形瓶）。分装量需匹配用途：试管分装10ml（用于制备斜面，凝固后斜面长度占试管1/3）；锥形瓶分装量不超过容器容积的2/3（如500ml锥形瓶分装300ml），避免灭菌时液体溢出。

分装后需立即密封：试管用棉塞或硅胶塞（棉塞需用脱脂棉，长度为试管口的2倍，塞入深度为棉塞长度的1/3）；锥形瓶用纱布包裹的棉塞或铝箔，确保透气且防污染。密封前需检查容器外壁是否有液体残留，用无菌纱布擦拭干净，避免灭菌时形成水垢。

培养基的灭菌工艺与有效性验证

高压蒸汽灭菌是最常用的方法，参数需根据培养基类型调整：非含糖培养基（如营养琼脂）采用121℃、15-20分钟；含糖培养基（如虎红琼脂）采用115℃、15分钟；含明胶的培养基（如明胶液化试验培养基）采用121℃、10分钟。灭菌时，灭菌锅需提前预热至100℃，排尽冷空气（压力表降至0后再升温），确保灭菌效果均匀。

灭菌后需立即冷却：非斜面培养基（如平板用培养基）需置于45℃水浴中保温，避免凝固；斜面培养基需趁热摆放（试管倾斜45℃，斜面长度占试管1/2），冷却2小时至完全凝固。冷却过程需避免污染，试管需置于无菌试管架，锥形瓶需用无菌铝箔覆盖。

灭菌有效性验证需做“双试验”：①无菌试验：取灭菌后培养基10ml，接种至无菌营养肉汤，37℃培养24小时，无浑浊或菌落生长为合格；②芽孢验证：将嗜热脂肪芽孢杆菌孢子条（ATCC7953）放入培养基中，灭菌后培养48小时，无孢子萌发为合格。每批培养基需做10%的样本验证，结果记录于《培养基制备记录》。

培养基的pH值调节与稳定性控制

pH值是微生物生长的关键参数，大多数水体检测用培养基的pH范围为7.0-7.4（如营养琼脂7.2±0.2，EMB琼脂7.1±0.2）。pH调节需在灭菌前进行，用1mol/L NaOH或HCl溶液，调节时需用pH计（精度0.01）实时监测，避免过量。例如，营养琼脂溶解后pH约为6.8，需逐滴加入NaOH溶液，直至pH升至7.4（灭菌后pH会下降0.2，最终为7.2）。

pH值的稳定性需通过“灭菌前后对比”验证：灭菌前测一次pH，灭菌后冷却至25℃再测一次，差值≤0.2为合格。若差值过大，需检查灭菌参数（如温度过高）或原料质量（如蛋白胨含酸类物质）。此外，保存过程中pH易受二氧化碳影响（如开放式保存），需密封保存并在1周内使用。

特殊培养基的pH调节需“个体化”：如酸性培养基（如孟加拉红琼脂，pH5.4）需用柠檬酸调节，避免NaOH与琼脂反应导致凝固；碱性培养基（如碱性蛋白胨水，pH8.6）需用Na2CO3调节，增强对霍乱弧菌的选择性。

培养基的倒平板与保存要求

倒平板需在培养基冷却至45-50℃时进行（温度过高会杀死后续接种的微生物，过低会导致培养基凝固无法铺展）。操作时，左手持平板（直径90mm），右手持锥形瓶，瓶口靠近平板边缘，缓慢倒入15-20ml培养基，旋转平板3次（顺时针、逆时针、顺时针），使培养基均匀覆盖平板底部（厚度3-5mm）。倒好后需静置30分钟，待表面干燥（无冷凝水）后倒置保存。

保存条件直接影响培养基的有效期：需置于4±2℃冰箱，避光（用黑色塑料袋或铝箔包裹），密封（平板用保鲜膜包裹，试管用硅胶塞密封）。不同培养基的保存时间不同：营养琼脂、EMB琼脂可保存2周；含糖培养基（如虎红琼脂）保存1周；选择性培养基（如SS琼脂）保存5天。保存期间需定期检查：若平板出现干裂、变色、霉点，需立即丢弃。

标签标注需清晰完整：每批培养基需标注“培养基名称、批号、制备日期、有效期、制备人”，例如“营养琼脂（批号20240315），2024-03-15制备，有效期至2024-03-29，制备人：张三”。标签需贴在容器侧面，避免覆盖视线。

培养基性能的质量控制试验

性能验证是培养基质量控制的核心，需覆盖“无菌性、促生长性、选择性、指示剂反应”四大维度：①无菌性试验：每批取5支试管或5个平板，37℃培养24小时，无生长为合格；②促生长试验：用标准菌株（如大肠埃希氏菌ATCC25922、金黄色葡萄球菌ATCC29213）接种，37℃培养24小时，菌落形态（如营养琼脂上的灰白色圆形菌落，直径2-3mm）、生长量（每平板菌落数≥100CFU）符合标准为合格；③选择性试验：用目标菌（如沙门氏菌ATCC14028）与非目标菌（如大肠埃希氏菌ATCC25922）同时接种，目标菌生长良好，非目标菌生长被抑制（如SS琼脂上大肠埃希氏菌菌落直径≤1mm，沙门氏菌菌落直径≥2mm）为合格；④指示剂反应试验：用发酵菌（如大肠埃希氏菌）接种EMB琼脂，菌落呈现紫黑色带金属光泽，非发酵菌（如沙门氏菌）呈现无色，符合指示剂预期为合格。

性能试验需每批进行，结果记录于《培养基质量控制记录》，不合格批次需立即废弃，不得用于检测。例如，某批EMB琼脂接种大肠埃希氏菌后，菌落无金属光泽，需检查伊红、美蓝的添加量或灭菌温度（如温度过高导致指示剂分解）。

培养基使用过程中的常见问题与解决方法

问题1：培养基凝固不全（平板倾斜后流动）。原因：琼脂添加量不足（如＜12g/L）、灭菌时间过长（琼脂分解）、冷却温度过高（未完全凝固）。解决方法：按配方补足琼脂量，缩短灭菌时间（121℃15分钟），冷却至25℃后再倒置。

问题2：菌落形态异常（如营养琼脂上大肠菌群菌落呈扁平状）。原因：pH值过低（＜7.0）、营养成分破坏（加热过度）、培养基干燥（保存时间过长）。解决方法：调节pH至7.2，控制溶解时间（≤2分钟），缩短保存时间（≤2周）。

问题3：培养基污染（平板出现杂菌菌落）。原因：灭菌不彻底（冷空气未排尽）、分装时污染（超净工作台未消毒）、保存时密封不良（保鲜膜破损）。解决方法：重新灭菌（排尽冷空气），分装前用75%乙醇消毒工作台，保存时用双层保鲜膜密封。

问题4：指示剂颜色异常（如EMB琼脂呈绿色而非深蓝色）。原因：伊红添加量不足（＜0.3g/L）、灭菌温度过高（指示剂分解）、pH值过高（＞7.3）。解决方法：按配方补足伊红量，降低灭菌温度（115℃15分钟），调节pH至7.1。