医学检验实验室检验方法确认与验证的技术要求及实施步骤

医学检验实验室的检验结果是临床诊断、治疗决策的核心依据，而检验方法的可靠性直接决定结果的准确性。无论是引入新的检测技术、应用非标准方法，还是验证已有的标准方法，确认与验证都是实验室质量体系中的关键环节——它不仅要满足ISO15189、CLIA等法规要求，更要保障临床需求的适配性。本文将从定义区分、技术要求到实施步骤，系统拆解医学检验方法确认与验证的核心要点，为实验室实践提供可操作的指引。

明确确认与验证的适用场景及定义边界

在医学检验领域，“确认”与“验证”是两个易混淆但本质不同的概念。根据ISO15189:2022的定义，“确认”针对的是“非标准方法、实验室自行开发的方法，或对标准方法的重大修改”——比如实验室为检测某种罕见病原体自行设计的PCR引物，或调整了标准方法的样本处理步骤（如从血清改为全血），这类方法需要通过确认证明其能满足预期用途。

而“验证”则适用于“已有的标准方法（如FDA批准的试剂盒、CLSI发布的检测规程）”，目的是证明实验室有能力正确执行该方法，确保结果与方法的预期性能一致。例如，实验室引入某品牌的乙肝表面抗原ELISA试剂盒，需要验证其在本实验室的设备、人员操作下，性能是否符合说明书要求。

简单来说，确认是“证明方法本身有效”，验证是“证明实验室能做好这个方法”。两者的边界清晰：当方法是“新的、非标准化的”，用确认；当方法是“已有的、标准化的”，用验证。

技术要求之方法选择的三大核心依据

无论是确认还是验证，方法的选择都需基于法规、实验室能力与临床需求的三重考量。首先是法规符合性：必须符合CLIA（美国临床实验室改进修正案）、ISO15189（医学实验室质量和能力认可准则）等要求，例如CLIA规定，非标准方法需经过确认并记录在案，否则不得用于临床检测。

其次是实验室能力匹配：要考虑现有设备（如是否有实时荧光PCR仪、质谱仪）、人员技能（如是否掌握基因测序的数据分析）、样本处理能力（如能否处理冷冻血浆样本）。例如，若实验室没有超高速离心机，就不宜选择需要超速离心的方法；若人员未接受过下一代测序（NGS）培训，就不应贸然引入NGS方法。

最后是临床需求适配：需结合检测的临床目的（如筛查、诊断、监测疗效）、样本类型（如血液、尿液、脑脊液）、疾病特点（如急性传染病需要快速检测，肿瘤标志物需要高灵敏度）。例如，针对手足口病的EV71病毒检测，临床需要快速出结果，因此选择胶体金免疫层析法（15分钟出结果）比PCR（2小时）更合适；而针对肺癌的EGFR基因突变检测，需要高灵敏度，因此选择数字PCR（最低检测限可达0.1%突变频率）比普通PCR更优。

技术要求之性能参数的量化标准

性能参数是衡量方法可靠性的核心指标，ISO15189要求必须对以下参数进行确认或验证：准确性、精密度、灵敏度、特异性、参考区间。

准确性（Accuracy）：指结果与“真实值”的接近程度，需通过参考物质（如NIST的标准物质）或参考方法（如国际公认的参考实验室的方法）进行验证。例如，检测血糖的方法，用NIST的葡萄糖参考物质做回收试验，回收率应在95%-105%之间（可接受标准）。

精密度（Precision）：包括批内精密度（同一次试验中同一样本的重复检测变异）和批间精密度（不同时间、不同人员的重复检测变异），通常用变异系数（CV）表示。例如，批内精密度要求CV≤5%（如ELISA方法），批间精密度要求CV≤10%（如PCR方法），具体数值需根据方法类型调整（如质谱法的CV要求更严格，≤3%）。

灵敏度（Sensitivity）：指方法能检测到的最低分析物浓度（最低检测限，LOD）或最低比例（如基因突变的最低检测限）。例如，新冠病毒核酸检测的LOD需≤500 copies/mL（根据WHO要求）；AFP（甲胎蛋白）检测的LOD需≤5 ng/mL（用于肝癌筛查）。

特异性（Specificity）：指方法排除非目标分析物干扰的能力，需验证交叉反应（如类似病原体、药物、自身抗体）。例如，检测梅毒的TP-ELISA方法，需验证是否会与类风湿因子（RF）、抗核抗体（ANA）产生交叉反应，若交叉反应率＞1%，则方法不可接受。

参考区间（Reference Interval）：指健康人群中某指标的正常范围，需根据实验室的人群特点（如年龄、性别、地域）建立或验证。例如，血常规的血红蛋白参考区间，男性为130-175 g/L，女性为120-155 g/L，但高原地区人群的参考区间需上调（如男性150-180 g/L），因此实验室需验证已有参考区间是否适用于本地人群。

实施步骤之前期准备：人、文、物的三重确认

实施确认或验证前，需完成三大准备工作：

1、成立跨学科小组：成员应包括检验技术人员（负责试验操作）、临床医生（提供临床需求指导）、质量管理人员（确保符合质量体系要求）、设备工程师（保障设备正常运行）。例如，某实验室引入新的肿瘤标志物CA125检测方法，小组由肿瘤内科医生（确认临床需求）、生化检验师（负责试验）、质量主管（审核流程）、设备工程师（校准化学发光仪）组成。

2、文献与法规调研：收集方法的相关文献（如PubMed上的方法学研究、试剂盒说明书、CLSI的指南）、法规要求（如FDA的试剂盒批准文件、ISO15189的条款），明确方法的原理、操作步骤、预期性能参数。例如，调研某PCR方法时，需查该方法的引物序列（是否有专利）、扩增条件（退火温度、循环数）、探针标记（是否为荧光素）。

3、设备与试剂准备：确认设备已校准（如天平的校准证书在有效期内，PCR仪的温度准确性已验证）、试剂在有效期内（如酶试剂需-20℃保存，避免反复冻融）、样本条件明确（如血清样本需4℃保存不超过24小时，否则需-80℃冷冻）。例如，做血糖检测的验证试验前，需确认葡萄糖氧化酶试剂在有效期内，生化分析仪的比色杯已清洗干净，样本是空腹静脉血（采集后30分钟内分离血清）。

实施步骤之试验操作：按参数逐一验证

准备完成后，即可开展具体试验，以下是关键参数的试验方法：

● 准确性试验：① 回收试验：取已知浓度的参考物质（如100 mg/dL的葡萄糖参考液），加入空白样本（如去蛋白血清），做回收试验，计算回收率（回收量/加入量×100%），要求回收率在95%-105%之间；② 比对试验：用待验证方法与参考方法（如已确认的方法）同时检测20-50份临床样本，计算两种方法结果的相关性（如Pearson相关系数r≥0.95）和偏差（如平均偏差≤5%）。

● 精密度试验：① 批内精密度：取同一份高、中、低浓度的样本（如血糖的高值150 mg/dL、中值100 mg/dL、低值60 mg/dL），每份做10次重复检测，计算CV值；② 批间精密度：连续5天每天检测同一份高、中、低浓度样本，计算CV值。要求批内CV≤5%，批间CV≤10%（根据方法调整）。

● 灵敏度试验：用参考物质做梯度稀释（如从1000 copies/mL稀释到1 copies/mL），每个浓度做5次检测，找到“能稳定检测到的最低浓度”（即LOD）。例如，某PCR方法的空白样本均值为10 copies/mL，标准差为5 copies/mL，则LOD=10+3×5=25 copies/mL，若预设LOD≤30 copies/mL，则达标。

● 特异性试验：用可能干扰的物质（如类似病原体、药物、自身抗体）做试验，看是否出现假阳性。例如，检测流感病毒H1N1的方法，需用H3N2、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒（RSV）的阳性样本做试验，若结果为阴性，则特异性符合要求。

● 参考区间验证：若使用已有参考区间（如试剂盒说明书中的参考区间），需用20-50份本实验室的健康人群样本做检测，若≥95%的样本结果在参考区间内，则验证通过；若需建立新参考区间，则需用至少120份健康人群样本，用百分位数法计算95%参考区间。

实施步骤之数据处理：用统计学判断“是否达标”

试验完成后，需用统计学方法分析数据，判断是否符合预设的可接受标准：

● 准确性：若用回收试验，计算回收率的均值和标准差，若均值在95%-105%之间，则达标；若用比对试验，用Bland-Altman图评估偏差分布，若95%的偏差在±5%范围内，则达标。

● 精密度：计算批内和批间的CV值（标准差/均值×100%），若CV值小于预设标准（如批内≤5%、批间≤10%），则达标。例如，某方法的批内CV为3.2%，批间CV为7.8%，均符合要求。

● 灵敏度：定量方法计算LOD（均值+3倍标准差），定性方法计算最低阳性浓度，若结果≤预设值（如新冠病毒LOD≤500 copies/mL），则达标。

● 特异性：计算交叉反应率（交叉反应阳性数/总测试数×100%），若≤1%，则达标。例如，用10份H3N2阳性样本试验，结果均为阴性，交叉反应率0%，符合要求。

需注意，可接受标准应结合法规、方法类型和临床需求制定——比如血糖检测的准确性偏差≤5%，NGS检测的准确性偏差≤10%（因NGS变异更大）。

实施后的关键：记录与文件化

ISO15189要求，确认与验证的所有过程必须文件化，保留至少5年（或按法规要求）。记录内容应包括：

● 试验基本信息：日期、人员、方法名称、设备型号（如Abbott ARCHITECT i2000）、试剂批号（如20230501）、样本编号（如S20231001-001）。

● 试验步骤：操作流程（如PCR的变性温度95℃ 30秒，退火58℃ 30秒，延伸72℃ 30秒，共40循环）、样本处理方法（如血清离心3000 rpm 10分钟）。

● 数据与结果：原始数据（如吸光度值、Ct值）、统计结果（如回收率98%、批内CV3.2%）、可接受标准、结论（如“准确性达标”）。

● 偏差与纠正：若结果不达标（如精密度CV12%），需记录原因（如设备校准过期）、纠正措施（重新校准后重测）、再次试验结果（如CV8%，达标）。

文件化的目的是“可追溯”——当临床出现异常结果时，能通过记录回溯试验过程；当质量审核时，能证明方法符合法规要求。例如，某实验室的CA125结果异常，通过记录发现是试剂过期，及时纠正避免了错误报告。