医学检验中自身免疫性肝病相关抗体检测的标准化流程

三方检测机构-冯工 2023-12-27 0 行业资讯

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自身免疫性肝病（AILD）是一类由自身免疫异常介导的肝脏疾病，涵盖自身免疫性肝炎（AIH）、原发性胆汁性胆管炎（PBC）、原发性硬化性胆管炎（PSC）等，其诊断与病情监测高度依赖相关抗体检测。然而，不同实验室因标本处理、试剂选择、操作流程的差异，常导致结果不一致，直接影响临床决策。建立标准化检测流程是消除实验室间差异、保证结果准确性的核心，对AILD的早期诊断、治疗方案选择及预后评估具有不可替代的作用。

标本采集与预处理的标准化要求

自身免疫性肝病抗体检测的标本以血清为首选，采集前需告知患者空腹8-12小时，避免高脂饮食、饮酒或服用免疫抑制剂（如泼尼松），防止干扰免疫反应。采集时使用无抗凝剂的真空采血管，严格无菌操作，防止标本污染。

标本转运需保持2-8℃低温，采集后4小时内完成离心（3000rpm，10分钟），分离血清并转移至干净EP管。若无法及时检测，血清需冻存于-20℃以下（避免反复冻融），复融时室温缓慢融化并充分混匀。

需严格拒收不合格标本：溶血标本（血红蛋白会与抗体结合，导致假阳性）、脂血标本（乳糜颗粒散射光影响吸光度读数）、凝固不全标本（纤维蛋白原黏附酶标板，干扰结果）。不合格标本需及时通知临床重新采集，并记录拒收原因。

试剂与设备的标准化管理

试剂选择需优先选用CFDA（或CE、FDA）认证的产品，确保灵敏度与特异性符合临床要求。使用前核对试剂批次、效期及保存条件（如2-8℃冷藏），避免使用过期或保存不当的试剂（如酶结合物冻融后出现沉淀）。

试剂批次更换时需做比对试验：选取20份临床标本（10份阳性、10份阴性），用新旧批次试剂同时检测，结果一致性需≥95%，否则需更换试剂或联系厂家确认。

设备管理需定期校准与维护：酶标仪、洗板机每年由计量机构校准，日常使用前检查温度（酶标仪温育箱需稳定在37℃±0.5℃）、转速（离心机误差≤50rpm）。洗板机每周清洁管路，防止洗液残留导致交叉污染；酶标仪每月清洁滤光片，保证吸光度读数准确。

检测方法的选择与方法学验证

自身免疫性肝病抗体检测常用方法有间接免疫荧光法（IIF）、酶联免疫吸附试验（ELISA）、化学发光免疫分析法（CLIA）。IIF以肝、肾组织切片为底物，是筛查“金标准”，但判读依赖经验；ELISA定量检测，适合阳性标本确认；CLIA自动化程度高，适用于大样本量检测。

实验室需根据定位选择方法：基层实验室用IIF+ELISA组合，三级医院引入CLIA提高效率。无论选哪种方法，均需做方法学验证：

灵敏度验证：用已知低浓度阳性标本（如AMA-M2 25U/mL，参考值<20U/mL），结果需为阳性；特异性验证：用类风湿关节炎、系统性红斑狼疮标本检测，结果需为阴性；重复性验证：同一份阳性标本测10次，CV≤10%；线性验证：5个浓度标准品（0、50、100、150、200U/mL），相关系数R²≥0.99。

操作步骤的规范化执行

以ELISA法检测AMA-M2为例，操作需严格遵循说明书：

1、加样：标准品（6个浓度）、质控品（高、中、低）及标本按顺序加样100μL，用校准移液器，避免气泡或交叉污染。

2、温育：酶标板放37℃温育箱60分钟，温育前预热30分钟，避免箱门附近温度过低。

3、洗板：自动洗板机洗5次，每次300μL洗液浸泡30秒，拍干时轻按酶标板，避免孔底残留液体。

4、加酶结合物：每孔100μL，振荡混匀后37℃温育30分钟，再次洗板。

5、底物反应：加TMB底物100μL，避光孵育15分钟（溶液呈蓝色），加终止液100μL（变为黄色），10分钟内用酶标仪读450nm吸光度（参考波长630nm）。

操作中需戴手套，避免手接触试剂；计时准确，不得缩短温育时间（如将60分钟减至45分钟会降低灵敏度）；试剂平衡至室温后使用，防止冷链断裂影响活性。

质量控制体系的建立

室内质控每天做定值质控品（如AMA-M2高值60U/mL、中值30U/mL、低值25U/mL），结果需在±2SD范围内（如中值参考范围28-32U/mL）。若失控，立即查因：

—— 试剂问题：是否过期、污染；

—— 操作问题：加样量不足、温育时间不够；