医学检验中新型冠状病毒核酸检测的实验室操作规范与质控

新型冠状病毒（COVID-19）核酸检测是诊断新冠感染的“金标准”，其结果准确性直接关系疫情防控决策与患者诊疗安全。实验室操作规范与质量控制（质控）是保障检测可靠性的核心，需覆盖环境设备、试剂样本、提取扩增、结果判读等全流程。本文结合临床实验室实践，系统梳理新冠核酸检测的操作要点与质控策略，为标准化运行提供参考。

实验室环境与设备的基础要求

新冠核酸检测实验室需严格划分4个功能区：试剂准备区（配制PCR反应体系）、样本处理区（核酸提取）、PCR扩增区（反应液扩增）、产物分析区（结果判读）。各区需物理隔离，避免交叉污染——试剂准备区需无核酸污染，禁止放置样本；样本处理区需配Ⅱ级生物安全柜（BSC），保持负压防止气溶胶扩散；扩增区仅用于反应液加热，与产物区完全隔离。

设备需满足精度与防护要求：PCR仪需定期校准温度均一性（误差≤0.5℃），生物安全柜每年检测风速与过滤器效率，离心机需带4℃冷冻功能，移液器每6个月校准（误差≤1%）。环境消毒每日操作前用紫外灯照射30分钟，操作后用500mg/L含氯消毒液擦拭台面，每周用75%乙醇清洁PCR仪内部。

试剂与样本的管理规范

试剂需严格冷链存储：提取试剂与扩增试剂通常-20℃冷冻，复融后分装单次用量（避免反复冻融），使用前冰上解冻、混匀并短暂离心（1000rpm，1分钟）。启用前核对有效期与批号，若试剂浑浊或标签模糊立即停用。

样本管理覆盖全流程：采集后装密封生物安全袋（含吸水垫），4℃冷藏运输（≤24小时）；实验室接收时核对身份、样本类型（鼻咽/咽拭子）与状态（无溶血、凝固），不合格样本注明原因退回。样本需2小时内处理，无法及时处理则-70℃冷冻（避免反复冻融）。

样本处理的标准化操作

样本处理需在生物安全柜内进行，操作人员穿三级防护（帽子、N95口罩、护目镜、防护服、双层手套、靴套）。操作前开风机30分钟，用75%乙醇擦台面。优先选磁珠法提取：样本与裂解液混合振荡30秒，加磁珠孵育5分钟（核酸结合磁珠），洗涤液去除杂质，洗脱液（50μL）60℃孵育5分钟洗脱核酸。

提取中需注意：每样本换枪头防交叉污染，洗脱液缓慢加至磁珠表面，提取后核酸立即扩增（若暂存则-20℃≤24小时）。禁止在样本处理区配PCR体系，避免试剂污染。

PCR扩增的操作要点

反应体系在试剂准备区配制，冰上操作保持酶活性。添加顺序：水→缓冲液→dNTP→引物→酶→模板（最后加模板防污染），配好后短暂离心去气泡。用校准移液器加样，确保每管体积一致（25/50μL）。

扩增程序按说明书设置：95℃预变性3分钟，95℃变性15秒、55℃退火30秒、72℃延伸30秒循环40次，72℃终延伸5分钟。需设对照：阳性对照（验证试剂有效）、阴性对照（判污染）、空白对照（判体系纯净）。

结果判读与报告的规范

阈值设为阴性对照荧光均值加10倍标准差，Ct值<37为阳性，37-40为灰区，>40为阴性。灰区需复核：重新提取核酸用原试剂扩增，仍灰区则换试剂（不同靶点如ORF1ab/N基因），结合临床症状（发热）、流行病学史（接触史）判断。

阳性结果需双人核对，2小时内通知疾控与临床；报告内容含患者信息、样本类型、检测方法（实时荧光RT-PCR）、靶点（ORF1ab/N）、Ct值、结果与时间，禁止模糊表述（如“疑似阳性”）。

室内质量控制的实施策略

室内质控每批同步做，选第三方定值质控（低浓度Ct≈35、中≈30、高≈25），与患者样本同流程处理。质控数据记Levey-Jennings图，Ct值超±2SD需查因（试剂复融不充分），超±3SD则停检：检查试剂有效性、校准设备、重新提取质控品，合格后恢复检测。

每月回顾质控趋势（如Ct渐高提示试剂效价降），调整操作（换试剂批号）。质控记录保存2年以上，便于追溯。

交叉污染的防控措施

空间防控：各区静压差≥10Pa，气流从试剂区→样本区→扩增区→产物区，避免逆流。人员按流程流动，禁止逆行（如从产物区回样本区）；操作后在各区脱防护装备，产物区装备单独存放。

物品与环境防控：各区物品专用（如试剂区枪头不跨区），每月用拭子擦台面/设备测核酸（阳性则用1000mg/L含氯消毒液擦、紫外照60分钟）。操作中用带滤芯枪头，开样本管盖慢转防飞溅，扩增后反应管密封防泄漏。

人员培训与能力评估

人员需持PCR上岗证，岗前培训含理论（新冠病毒RNA结构、PCR原理、三级防护穿戴）与操作（提取、扩增一对一指导）。每年复训更新知识（如试剂新批号操作），每半年评估：理论考试（≥80分）、操作考核（盲样100%准确）、生物安全考核（穿戴≤5分钟无遗漏）。

操作人员需测体温（≤37.3℃）上岗，每周做核酸检测，避免感染污染实验室。