药品检测中微生物限度检测的标准操作流程和注意事项

微生物限度检测是药品质量控制的核心环节之一，主要用于评估非无菌药品（如口服固体制剂、外用软膏、液体制剂等）中的微生物污染水平，直接关联用药安全性与有效性。该检测需严格遵循《中国药典》（2020版）、ICH Q3A等标准要求，其操作的规范性不仅影响结果准确性，更关乎药品能否合规上市。本文将详细拆解微生物限度检测的标准操作流程，并梳理各环节的关键注意事项，为实验室日常操作提供可落地的参考。

样品接收与预处理的标准流程

样品接收是检测的第一步，需核对药品名称、批号、规格、生产企业、包装完整性及贮存条件，确认无误后登记《样品接收台账》——若包装破损或贮存不当（如冷藏样品未冷链运输），应直接拒收，防止污染或微生物滋生影响结果。

预处理需根据样品形态调整：固体样品（如片剂）称取10g，加入90ml pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液，用匀浆器以8000r/min匀浆2分钟，制成1:10供试液；液体样品（如口服液）取10ml直接加入90ml稀释剂摇匀；半固体样品（如软膏）需加含聚山梨酯80的缓冲液，加热至40-45℃融化后匀浆。

预处理的关键注意事项：稀释剂需121℃高压灭菌15分钟；若样品含抑菌成分（如防腐剂），需加中和剂（如硫代硫酸钠中和含氯消毒剂），中和剂用量需验证（标准菌株回收率≥70%）；匀浆时控制时间与速度，避免破坏微生物细胞。

例如某抗生素软膏的预处理：称10g样品加90ml含1%卵磷脂+1%聚山梨酯80的缓冲液，42℃融化后匀浆3分钟——卵磷脂中和季铵盐防腐剂，聚山梨酯80增加溶解性，确保微生物充分分散。

环境与设备的准备要求

检测需在洁净度不低于D级的环境中进行，操作前开启超净工作台紫外灯30分钟，通风15分钟；用75%乙醇擦拭台面、移液器等设备，确保表面无菌。

设备需定期校准：超净工作台风速0.36-0.54m/s（过低无法阻挡外界空气）；培养箱温度需预热至30-35℃（细菌）或20-25℃（真菌），温差≤1℃；移液枪误差≤1%，避免移液量偏差。

人员需穿无菌服、戴手套口罩，用75%乙醇消毒手套；操作中减少走动与说话，咳嗽时背对台面——每月做手卫生监测（手指涂抹法），确保手上微生物≤10CFU/指。

例如某实验室的环境监测：每天用沉降菌平板（营养琼脂）放置30分钟，培养后≤10CFU/皿（符合D级要求）；每月测浮游菌≤100CFU/m³，确保环境合规。

培养基与试剂的适用性验证

培养基需验证三项指标：促生长试验（接种金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌，回收率≥90%）、抑制试验（如麦康凯琼脂抑制革兰阳性菌）、指示反应试验（如伊红美蓝琼脂使大肠埃希菌显紫黑色带金属光泽）。

试剂处理：稀释剂、中和剂需高压灭菌，灭菌后做无菌检查（取10ml培养无菌落）；染色剂确认有效期，避免染色错误。

注意事项：培养基融化后冷却至45-50℃（过高烫死微生物，过低凝固无法混匀）；融化后未用完的培养基4℃冷藏24小时内使用，避免反复加热破坏营养；标准菌株传代不超过5代，防止性状改变。

例如营养琼脂的促生长试验：取10-100CFU金黄色葡萄球菌菌液1ml，倒入45℃营养琼脂，35℃培养48小时，回收率≥90%才算合格。

接种与培养的操作规范

接种需在超净工作台内进行：用无菌移液枪取1ml供试液注入平皿，倒入15-20ml融化的培养基，摇匀凝固后倒置培养；粘性大的供试液用涂布法（将0.1ml供试液涂在凝固的培养基表面）。

培养条件：细菌30-35℃培养48小时，真菌20-25℃培养72小时；培养箱相对湿度≥70%（放水盘加湿），避免培养基干裂；同一培养箱不能同时培养细菌与真菌，防止交叉污染。

例如口服片剂的细菌计数：1:10供试液1ml注入平皿，加营养琼脂培养后，若菌落数50CFU，则样品细菌数50×10=500CFU/g（符合≤1000CFU/g的限度）。

微生物计数与结果判定

培养后计数：细菌选30-300CFU的平板，真菌选10-150CFU的平板，取平均菌落数乘以稀释倍数；若所有平板菌落数低于30CFU，取最低稀释倍数的平均值；高于300CFU则稀释更高倍数重测。

计数注意事项：细菌菌落圆形光滑，真菌菌落绒毛状或粉末状；蔓延生长的菌落（如变形杆菌）不计，改用涂布法；用菌落计数器减少人为误差，记录菌落数、稀释倍数、培养基类型。

结果判定需符合药典：口服固体制剂细菌≤1000CFU/g、真菌≤100CFU/g；外用软膏细菌≤100CFU/g、真菌≤10CFU/g；结果超标需复查（重测平行样、换培养基），排查污染或操作失误。

例如某软膏真菌计数：1:10供试液平板菌落15CFU，真菌数15×10=150CFU/g（超≤10CFU/g的限度），需复查样品是否受潮、培养基是否污染。

膜过滤法的应用与注意事项

含强抑菌成分的样品（如抗生素滴眼液）需用膜过滤法：取10ml供试液通过0.45μm无菌滤膜，用50-100ml稀释剂冲洗（除去抑菌成分），再将滤膜贴在培养基表面培养。

注意事项：滤膜孔径0.45μm（截留微生物）；过滤速度5-10ml/min（避免压破微生物）；冲洗液体积足够（100ml/膜）；滤膜贴培养基时避免气泡（影响生长）。

例如某抗生素滴眼液检测：滤膜截留微生物，冲洗液除去抗生素，确保微生物在营养琼脂上生长，结果更准确。

交叉污染的多环节防控

操作台面分区（样品处理区、接种区），避免样品与培养基交叉；移液枪头、平皿一次性使用，打开后尽快用；样品瓶口用酒精灯火焰消毒，防止空气微生物进入；废液废平皿需高压灭菌后处理。

处理多个样品时：先处理无抑菌成分的（如片剂），再处理含抑菌成分的（如软膏）；每个样品用独立移液枪头，避免交叉；操作后用75%乙醇擦台面，紫外消毒30分钟。