沐浴类日化产品检测中霉菌酵母菌的检测流程与计数方法

沐浴类日化产品（如沐浴露、沐浴乳、浴盐等）因含水分、表面活性剂及部分营养成分，易成为霉菌、酵母菌的滋生载体。这类微生物超标不仅会导致产品变质、异味，还可能引发皮肤瘙痒、过敏等问题，因此是产品质量检测的关键指标。本文结合《化妆品安全技术规范》《食品安全国家标准 食品微生物学检验 霉菌和酵母菌计数》等标准，详细梳理沐浴类产品中霉菌酵母菌的检测流程与计数方法，为实验室检测及企业质量控制提供实操参考。

样品采集与制备

样品采集需遵循无菌操作原则，优先选取保质期内、未开封的成品；若为批次检测，需从同一批次的不同包装（如10-20瓶）中随机抽取，每瓶取5-10g（ml）混合为代表性样品。液体类沐浴露直接用无菌吸管吸取，摇匀后待用；半固体（如沐浴乳）需充分搅拌均匀，固体类（如浴盐）需用无菌剪刀剪碎，再称取10g样品加入90ml无菌生理盐水中，用均质器以8000-10000r/min的速度均质2-3分钟，制成1:10的样品匀液。

制备过程中需避免样品被外界微生物污染：均质器的探头需提前用75%乙醇消毒并晾干；盛装样品的容器需为无菌玻璃瓶或聚乙烯瓶；若样品含磨砂颗粒（如浴盐），需用无菌纱布过滤去除颗粒，仅取滤液检测——颗粒本身不易滋生微生物，过滤可避免其干扰计数结果。

样品梯度稀释

霉菌酵母菌的计数需选择菌落数在10-150CFU（菌落形成单位）之间的稀释度，因此需对样品匀液进行梯度稀释。取1:10的样品匀液1ml，加入9ml无菌生理盐水中，用漩涡混合器混合30秒，制成1:100的稀释液；再从1:100稀释液中取1ml加入9ml无菌生理盐水，制成1:1000的稀释液，依此类推，通常做3-5个稀释度（如10⁻¹、10⁻²、10⁻³）。

稀释操作的关键点是“单一方向、避免回流”：用吸管吸取样品时，需将吸管尖端插入稀释液液面下1-2cm，缓慢释放样品；每换一个稀释度需更换新的无菌吸管，防止高浓度样品残留影响低浓度稀释液的准确性。若样品含 parabens 类防腐剂，需在稀释时加入卵磷脂（1g/L）与吐温-80（7g/L）的混合中和剂——中和剂的用量需提前通过验证试验确定，确保不抑制霉菌酵母菌生长。

培养基的选择与制备

沐浴类产品中霉菌酵母菌的检测优先选择虎红琼脂培养基，其配方包含蛋白胨（10g/L）、葡萄糖（20g/L）、琼脂（15g/L）、虎红（0.033g/L）及氯霉素（0.1g/L）。虎红可抑制细菌生长并使霉菌菌落呈红色，氯霉素抑制革兰氏阳性菌，葡萄糖和蛋白胨为微生物提供碳源与氮源，是霉菌酵母菌的专属选择性培养基。

培养基制备需严格遵循无菌操作：将各成分加入蒸馏水中，加热煮沸至完全溶解，用pH计调整pH至7.0±0.2；分装至三角瓶中，用无菌纱布包裹瓶口，121℃高压蒸汽灭菌15分钟；灭菌后将培养基冷却至45-50℃，加入氯霉素（避免高温破坏其活性），倒入无菌平皿（每皿15-20ml），待凝固后倒置保存（4℃冰箱，保质期1周）。若培养基出现凝固、变色或浑浊，需丢弃重制。

接种与培养操作

接种通常采用“倾注法”：取每个稀释度的样品稀释液1ml，缓慢注入无菌平皿中（每个稀释度做2个平行平皿）；立即倒入45-50℃的虎红琼脂培养基，轻轻旋转平皿（顺时针、逆时针各转3圈），使稀释液与培养基充分混合；待培养基完全凝固后（约15分钟），将平皿倒置放入恒温培养箱。

培养条件需严格控制：温度设定为28±1℃（霉菌酵母菌的最适生长温度），培养时间为5-7天——若培养3天后发现菌落过多，可提前计数，但需确保所有可见菌落都已长成；若培养7天后仍无明显菌落，需延长培养至10天（部分慢生长霉菌可能延迟生长）。培养过程中需保持培养箱相对湿度在60%-70%，避免菌落扩散或培养基干裂。

霉菌酵母菌的计数方法

计数需在培养结束后24小时内完成，避免菌落变形。首先观察菌落形态：酵母菌落为圆形、光滑、湿润的小菌落（颜色多为白色或乳白色）；霉菌菌落为绒毛状、絮状或蜘蛛网状的大菌落（颜色多样，如绿色、黑色）。计数时需选择菌落数在10-150CFU之间的平皿——若同一稀释度的两个平行平皿菌落数差值超过1倍（如一个50CFU、一个120CFU），需重新检测；若差值在1倍以内，取两者平均值。

计算公式为：霉菌酵母菌数（CFU/g或CFU/ml）=（平行平皿平均菌落数×稀释倍数）/接种样品量（1ml）。例如：某沐浴露1:100稀释度的两个平皿菌落数为45和55，平均值为50，则该样品的霉菌酵母菌数为50×100=5000 CFU/ml。需注意：蔓延生长的菌落不计入（若整个平皿被覆盖，该稀释度无效）；若所有稀释度都超过150CFU，取最高稀释度的菌落数计算；若所有稀释度都低于10CFU，结果报告为“＜10×最低稀释倍数”（如最低稀释度1:10，报告＜100 CFU/g）。

结果判断与异常处理

沐浴类产品的霉菌酵母菌限量遵循《化妆品安全技术规范》（2015版）：成人用产品≤100 CFU/g（ml），儿童用产品≤50 CFU/g（ml）。若结果超标，需立即复检——重新采集同一批次样品，调整中和剂用量（若样品含防腐剂）或更换培养基，重复检测2次；若复检仍超标，需排查污染来源：原料（如天然提取物未达标）、生产过程（如乳化锅未消毒）、包装（如瓶口密封不严）。

若检测中出现“无菌落生长”的异常情况，需排查以下因素：稀释液中的中和剂不足（未抑制防腐剂）、培养基失效（氯霉素过期）、培养温度错误（如设为37℃）。针对这些问题，需重新调整中和剂用量、更换新培养基、确认培养温度，再进行检测。

检测过程的质量控制要点

为确保结果准确，实验室需建立质量控制体系。首先是“对照试验”：每次检测需同时做阳性对照（将黑曲霉ATCC 16404或白色念珠菌ATCC 10231标准菌株制成10-100 CFU/ml的菌悬液，按相同流程接种，若菌落数在预期范围内，说明培养基与培养条件正常）和阴性对照（用无菌生理盐水代替样品，若无菌落生长，说明操作无外界污染）。

其次是人员与设备控制：检测人员需经专业培训，能准确区分霉菌与酵母菌落；均质器每3个月校准一次转速，培养箱每月校准一次温度，pH计每两周校准一次；无菌器材（吸管、平皿）需经121℃高压灭菌30分钟，或使用一次性无菌器材。此外，实验室需定期参加CNAS组织的微生物计数能力验证，确保结果与其他实验室一致。