水质检测中总大肠菌群和耐热大肠菌群的培养方法

总大肠菌群与耐热大肠菌群是水质卫生安全的核心微生物指标——总大肠菌群反映水体受粪便污染的总体水平，耐热大肠菌群（以大肠埃希氏菌为代表）则直接指示近期污染，与饮用水致病风险强相关。准确的培养方法是检测这两类菌群的核心，其操作细节（如采样、培养基匹配、温度控制）直接影响结果可靠性。本文结合实际检测流程，拆解两类菌群的培养要点，为水质检测人员提供可落地的操作指引。

样品采集与预处理：避免污染的第一步

样品的采集与预处理是检测的基础。采样容器需用121℃高压灭菌20分钟的广口玻璃瓶，采样时沿取水点水面下10-20cm处缓慢注入，避免气泡产生（防止样品与空气接触）；采集自来水需先放水3-5分钟，排尽管道内 stagnant水。采样后立即密封，置于4℃冷藏箱运输，2小时内送达实验室；若无法及时检测，4℃保存不超过24小时，避免菌群失活。

预处理需适配样品性状：浑浊样品轻轻摇匀，不破坏菌群结构；高氯样品（如消毒后的自来水）需加硫代硫酸钠中和——每500ml样品加0.1ml 10%硫代硫酸钠，消除余氯对微生物的抑制；含颗粒物的样品无需过滤，直接摇匀接种即可。

培养基选择与制备：匹配菌群生长特性

总大肠菌群用乳糖蛋白胨培养液，含蛋白胨（氮源）、乳糖（发酵底物）、牛肉膏（营养补充）、溴甲酚紫（pH指示剂，酸变黄）。制备时溶解各成分，调pH至7.2-7.4，分装加倒置杜氏小管（观产气），121℃灭菌15分钟。注意灭菌温度不可过高，否则乳糖焦化影响发酵；灭菌后冷却至室温，避免杜氏小管进空气。

耐热大肠菌群需用EC培养液（含胆盐，抑制革兰阳性菌），制备时先将胆盐用温水溶解，再混合其他成分，避免结块。滤膜法用EC-MUG培养基，添加MUG（4-甲基伞形酮-β-D-葡萄糖醛酸苷），通过荧光反应快速检测大肠埃希氏菌（其β-葡萄糖醛酸酶分解MUG产荧光）。

接种方法（一）：多管发酵法——适用于各类水质

总大肠菌群的多管发酵法按“3×3”模式接种：准备3组乳糖蛋白胨管，分别接种10ml、1ml、0.1ml样品（1ml样品需稀释至10ml，0.1ml稀释至100ml）。接种时用无菌吸管沿管壁注入，避免碰杜氏小管，振荡混合均匀。

耐热大肠菌群需转种初发酵阳性管：将总大肠初发酵阳性的乳糖管，用无菌接种环挑1环转种EC培养液，每管1环。转种时接种环需冷却，避免烫伤菌群，加杜氏小管后44.5℃培养。

接种方法（二）：滤膜法——快速检测低浊度水

滤膜法适用于饮用水等低浊度水：用0.45μm滤膜过滤100ml样品，真空泵抽滤使微生物截留在滤膜表面。抽滤速度需慢，避免滤膜破损；浊度高时减少过滤体积（如50ml）。

总大肠菌群将滤膜贴远藤氏琼脂或EMB平板——远藤氏琼脂含碱性复红，大肠菌群发酵乳糖产酸使复红沉淀，形成红色菌落；EMB平板的典型菌落为紫黑色带金属光泽。贴滤膜时用无菌镊子夹边缘，避免气泡。

耐热大肠菌群贴EC-MUG平板，44.5℃培养24小时后，365nm紫外灯下观察荧光点（大肠埃希氏菌分解MUG产蓝荧光）。滤膜需提前检查有无破损，避免假阴性。

培养条件控制：精准把控温度与时间

温度是核心：总大肠36±1℃培养24±2小时，耐热大肠44.5±0.2℃培养24±2小时。培养箱需用检定温度计校准，确保偏差≤0.2℃——44.5℃过高会杀目标菌，过低会让杂菌生长。

时间需严格：24小时准时观察，总大肠提前看可能未产气，超时则杂菌繁殖；耐热大肠EC管产气、EC-MUG荧光均需24小时判断，超时荧光减弱。培养箱湿度保持70%以上，底部放水盘避免培养基干燥。

结果观察与确认：避免假阳性假阴性

总大肠初发酵看产气（杜氏小管有气泡）或产酸（溴甲酚紫变黄），阳性管转种EMB平板，24小时后长紫黑色带金属光泽的典型菌落，挑菌再接种乳糖管，产气确认阳性。非典型菌落需革兰染色（大肠为革兰阴性短杆菌）。

耐热大肠看EC管产气或EC-MUG荧光：EC管产气即为阳性，荧光需在暗室观察，避免自然光干扰。注意EC管产气需匹配44.5℃，否则可能来自非耐热菌群。

质量控制：确保结果可靠

空白对照用无菌水按流程接种，若阳性说明污染（培养基灭菌不彻底、操作不规范），需重测。阳性对照用大肠埃希氏菌ATCC25922接种，需产气或产荧光，阴性则培养基失效或温度错误。

定期检查培养基：乳糖管溴甲酚紫应为紫色，变黄则变质；EC管胆盐无结块；滤膜孔径0.45μm，用前无菌检查（接种后无菌落）。操作时无菌操作——手消乙醇，台面紫外照30分钟，吸管、接种环火焰灭菌（接种环烧红冷却后用）。