微生物限度检测中标准菌株的传代次数对检测结果的影响如何控制

微生物限度检测是药品、食品、化妆品等产品质量控制的核心环节，标准菌株作为检测的“生物基准”，其特性稳定性直接决定结果的准确性与可靠性。传代次数是影响菌株稳定性的关键因素——菌株在反复转接培养中，可能因基因随机突变或生理适应性改变，导致菌落形态、生化反应、生长速率等关键特性变异，进而造成检测结果偏差、方法验证失败甚至误判。因此，系统梳理传代次数的影响机制，并建立科学的控制策略，是微生物限度检测合规性的重要支撑。

标准菌株传代的基本概念与必要性

标准菌株指从国际或国家认可机构（如ATCC、CMCC）获得的、具有明确遗传背景的菌株，通常以冷冻干燥或超低温冻存形式保存。传代是将菌株从一种培养基转接至另一种培养基的过程，目的是活化休眠菌株或扩大培养量——例如，冷冻干燥的原始菌株需接种至肉汤培养基（37℃，24小时）才能恢复活力，这是第一次传代。

传代是检测的必要步骤：冻存菌株代谢活性低，需传代恢复生长；检测需大量均匀的菌株，传代可满足数量需求。但传代次数越多，变异风险越高——菌株每传代一次，DNA复制可能发生随机突变，累积后会改变表型。因此，传代需“适度”，而非“无限次”。

需明确“传代次数”的计数规则：原始菌株为0代，每转接一次增加1代。例如，原始菌株活化后为1代，从1代传至工作菌株为2代，依此类推。

传代次数影响菌株特性的机制

菌株的稳定性依赖遗传物质的完整性。传代中，DNA复制的错配修复机制并非完美，会发生点突变、缺失突变等。例如，大肠埃希菌的lacZ基因（编码β-半乳糖苷酶）突变，会导致乳糖发酵能力下降，原本能产酸产气的菌株，传代10次后可能无法发酵，影响生化鉴定。

生理适应性改变也是重要因素。菌株会适应培养条件（如葡萄糖浓度、温度），调整代谢路径。例如，枯草芽孢杆菌在高葡萄糖培养基中传代，会抑制芽孢形成基因表达，芽孢产量下降90%，影响控制菌检查的阳性对照有效性。

环境压力（如反复冻融）会加速变异。例如，甘油管反复冻融3次以上，菌株细胞膜受损，生长速率减慢20%，菌落直径从2.5mm缩小至1mm，直接干扰计数准确性。

传代次数对微生物限度检测的具体影响

传代次数超标会干扰“计数”与“鉴定”核心环节。例如，总需氧菌数（TAMC）计数中，传代8次的枯草芽孢杆菌生长速率下降，培养48小时后菌落未完全形成，计数结果比实际低30%。

控制菌检查中，传代10次的大肠埃希菌uidA基因缺失，无法分解MUG产生荧光，导致阳性对照误判为阴性，险些漏检不合格产品。

方法验证中，传代7次的金黄色葡萄球菌凝固酶活性下降，回收率从98%降至72%，不符合“≥70%”的要求，误以为方法不适用。

药典对传代次数的明确限制

各国药典均规定标准菌株传代次数不得超过5代（从原始菌株计数）——《中国药典》2020版通则1105、USP<61>、EP<2021>均有此要求。

“5代”是稳定性研究的结果：5代内菌株遗传突变率<0.01%，特性一致性>99%；超过5代后，突变率指数上升，第10代特性一致性降至85%以下。例如，ATCC6538金黄色葡萄球菌第5代凝固酶活性100U/mL，第10代降至40U/mL，无法满足阳性对照要求。

需注意：计数起点是原始菌株（0代），而非储备菌株。若工作菌株从储备菌株传代3次，即达到5代上限，必须停止使用。

“两级保藏体系”的实操方法

控制传代次数最有效的方法是建立“原始-储备-工作”两级保藏体系，避免连续传代：

1、原始菌株活化：将0代冷冻干燥管接种至肉汤，37℃培养24小时，得到1代菌株。

2、制备储备菌株：将1代菌株接种至琼脂平板，挑单菌落接种至10%甘油肉汤，分装10支冻存管（-80℃保存），每支为1代储备菌株，一次性使用。

3、制备工作菌株：检测前取1支储备菌株，接种至肉汤培养24小时，得到2代工作菌株，用于日常检测。

4、储备菌株补充：当储备菌株用完，需重新从原始菌株活化，而非从工作菌株传代。

通过此体系，工作菌株传代次数始终≤2代，远低于5代上限。

传代过程中的特性验证要点

每代菌株需验证“形态、生化、遗传”特性，确保与原始菌株一致：

1、形态学：观察菌落大小（1-3mm）、形状（圆形）、颜色（金黄色/乳白色）、边缘（整齐）。例如，金黄色葡萄球菌菌落应为“圆形、凸起、金黄色”，若变成灰白色扁平状，需淘汰。

2、生化反应：做标志性试验——大肠埃希菌IMViC试验（++--）、沙门菌H₂S试验（阳性）、铜绿假单胞菌氧化酶试验（阳性）。若大肠埃希菌甲基红试验阴性，说明基因变异。

3、遗传验证：用PCR检测特异性基因——大肠埃希菌uidA基因（147bp）、沙门菌invA基因（284bp），阴性则基因缺失，菌株变异。

4、生长特性：测定生长曲线，对比原始菌株的对数生长期（6-12小时）与OD600值（0.1→1.0），若对数期延长或OD值下降，需淘汰。

异常情况的处理与预防

若传代次数超标（如达到6代），需立即停止使用，销毁所有相关菌株，重新从原始菌株活化。若发现特性变异（如IMViC试验异常），需调查原因：是保藏温度波动？还是操作污染？

预防措施：定期检查冰箱温度（每天记录2次），确保-80℃稳定；操作时接种环灼烧至红热，避免交叉污染；每周对超净工作台做空气培养，确保无菌环境。

定期内部审核：检查台账记录（传代次数、验证结果）、保藏条件，确保体系合规。例如，审核中发现储备菌株反复冻融，需修订SOP，规定“储备菌株一次性使用”。