药品微生物限度检测中控制菌检查阳性对照菌株的复苏方法是什么

在药品微生物限度检测的控制菌检查中，阳性对照菌株的复苏是验证检测方法有效性的核心步骤。阳性对照用于确认试验条件下菌株能否正常生长，若复苏操作不规范，可能导致菌株活性丧失、纯度降低或性状改变，直接影响控制菌检查结果的可靠性。因此，建立标准化的复苏流程，对保障药品微生物质量控制的准确性具有重要意义。

一、复苏前的菌株与材料准备

阳性对照菌株需选用溯源清晰的标准菌株，如中国医学细菌保藏管理中心（CMCC）或美国典型培养物保藏中心（ATCC）的菌株，确保菌株的遗传稳定性与特性一致性。保存状态分为冻干、斜面及冷冻干燥三种：冻干菌株需在2-8℃密封保存，保质期通常为5年；斜面菌株需在4℃冰箱中保存，保存时间不超过3个月，且需定期转种以保持活性。

复苏所需材料包括：符合《中国药典》标准的液体培养基（如胰酪大豆胨液体培养基、营养肉汤）、无菌水或生理盐水、无菌吸管（1ml、10ml）、接种环、培养瓶（250ml）及超净工作台。培养基需提前灭菌（121℃、15分钟），并进行无菌检查（30-35℃培养24小时无杂菌生长）；无菌器材需经高压灭菌或环氧乙烷灭菌，确保无微生物污染。

环境准备方面，需在百级超净工作台中进行操作，操作前开启紫外灯消毒30分钟，关闭紫外灯后通风10分钟，同时用75%乙醇擦拭工作台面、培养瓶外壁及操作人员的手套，确保操作环境的无菌性。

二、冻干阳性对照菌株的复苏流程

冻干菌株的复苏需严格遵循“溶解-接种-培养”三步法。首先开启冻干管：用75%乙醇棉球擦拭管外壁2-3次，待乙醇挥发后，用无菌镊子轻轻折断冻干管顶端（或旋开螺纹盖），注意避免玻璃碎片落入管内。加入0.5-1ml预温至30-35℃的无菌胰酪大豆胨液体培养基，轻轻颠倒冻干管3-5次，使冻干物完全溶解，避免剧烈振荡导致菌体受损。

溶解后，用无菌1ml吸管吸取菌液，缓慢注入装有10-20ml预温液体培养基的培养瓶中，轻轻旋转培养瓶3-5次，使菌液与培养基充分混合。培养条件为30-35℃恒温培养箱，培养时间18-24小时，期间需每6小时观察一次菌液状态，若发现菌液浑浊度明显增加，说明菌株生长良好；若浑浊度低，需延长培养时间至24小时。

培养结束后，菌液需呈均匀浑浊状，无沉淀或絮状物。若出现沉淀，可能是溶解不充分或菌体受损，需重新复苏。

三、斜面保存阳性对照菌株的复苏步骤

斜面菌株的复苏流程相对简单，核心是“挑取-接种-培养”。首先，接种环需在火焰上灼烧灭菌，待冷却至室温后，轻轻挑取斜面培养基上的新鲜菌苔（约接种环前端1/3面积），注意避免挑取培养基底层的老化菌体。

将挑取的菌苔接入装有10-20ml预温液体培养基的培养瓶中，轻轻振荡培养瓶5-10秒，使菌苔均匀分散在培养基中。若菌苔未完全分散，可用接种环在培养基中轻轻搅拌2-3次，但需避免划破培养瓶内壁。

培养条件与冻干菌株一致，30-35℃培养18-24小时。培养结束后，菌液应呈均匀浑浊，无明显颗粒或絮状物，若菌液清澈，说明菌体未生长，需重新挑取菌苔接种。

四、复苏后菌株的有效性验证

复苏后的菌株需进行三项验证：浓度测定、纯度检查及特性验证。浓度测定常用麦氏比浊法：将菌液与0.5麦氏比浊管（对应菌浓度约1.5×10^8 CFU/ml）对比，若浓度过高，用无菌生理盐水稀释至所需浓度（如10^6 CFU/ml）；若浓度过低，需延长培养时间或重新复苏。也可采用平板计数法：取1ml菌液，用无菌生理盐水稀释至10^-6倍，取0.1ml涂布于胰酪大豆胨琼脂平板，30-35℃培养24小时，计数菌落数，计算菌液浓度。

纯度检查采用涂片染色镜检：取1滴菌液涂于载玻片上，自然干燥后用革兰氏染色液染色（结晶紫1分钟→碘液1分钟→95%乙醇脱色30秒→番红复染1分钟），镜检观察菌体形态。如大肠杆菌应为革兰氏阴性短杆菌，无芽孢；金黄色葡萄球菌应为革兰氏阳性球菌，呈葡萄状排列，若发现其他形态的菌体，说明存在杂菌，需重新复苏。

特性验证需进行生化反应：如大肠杆菌需做靛基质试验（加入靛基质试剂后呈红色）、甲基红试验（加入甲基红试剂后呈红色）及伏-普试验（呈阴性）；金黄色葡萄球菌需做血浆凝固酶试验（加入兔血浆后24小时内凝固）及甘露醇发酵试验（分解甘露醇产酸）。生化反应符合菌株特征，方可用于控制菌检查。

五、复苏操作的关键注意事项

无菌操作是复苏成功的核心，操作过程中需避免说话、咳嗽或用手触摸面部，手套需每30分钟更换一次，若接触非无菌物品，需立即更换。超净工作台的风速需保持在0.3-0.5m/s，操作前需用沉降菌法检测无菌状态（平板培养24小时后菌落数≤1 CFU）。

培养基的质量直接影响菌株生长，需使用有效期内的培养基，且灭菌后需检查pH值（胰酪大豆胨液体培养基pH值应为7.3±0.2），pH值过高或过低会抑制菌体生长。培养箱温度需校准，波动范围不超过±1℃，温度过低会延长生长时间，过高会导致菌体死亡。

菌株的传代次数需严格控制，复苏后的菌株传代次数不应超过5代，超过则需重新从冻干菌株复苏，防止菌株性状变异（如生化反应改变、毒力下降）。传代时，需记录传代日期、传代人及传代次数，建立菌株传代档案。

六、常见复苏问题的分析与处理

若复苏后菌液生长不良（浑浊度低），可能原因包括：冻干管溶解不充分（需延长溶解时间至10分钟）、培养基失效（更换新培养基并重新灭菌）、培养温度不适（校准培养箱温度）或菌体受损（更换冻干管重新复苏）。

若镜检发现杂菌，需检查操作过程：超净工作台是否消毒彻底、冻干管开启时是否接触非无菌表面、培养基是否污染。处理方法为：丢弃污染的菌液，重新复苏，并对操作环境进行全面消毒（用含氯消毒液擦拭超净工作台，紫外灯消毒1小时）。

若生化反应不符合菌株特征，可能是传代次数过多或保存不当导致性状变异，需更换新的标准菌株，重新复苏并验证。