食品抗氧化功效性验证中DPPH自由基清除率的测定步骤与参数

DPPH自由基清除率测定是食品抗氧化功效性验证中最常用的体外评价方法之一，因其操作简便、结果稳定且重复性好，被广泛应用于天然提取物、功能性食品及添加剂的抗氧化能力评估。该方法通过检测样品对DPPH自由基的清除能力，间接反映其抗氧化活性强弱，是连接食品原料活性成分与实际抗氧化功效的关键技术环节。本文将详细拆解DPPH测定的具体步骤、关键参数及注意事项，为食品研发与质量控制提供实操参考。

试剂与仪器的准备要求

DPPH测定的准确性首先依赖于试剂与仪器的规范选择。核心试剂包括DPPH标准品（需色谱纯，纯度≥98%，避免杂质干扰自由基稳定性）、无水乙醇（分析纯，水分含量≤0.1%，防止DPPH水解）、Trolox标准品（用于绘制标准曲线，纯度≥99%）及样品提取溶剂（如乙醇、蒸馏水或混合溶剂，根据样品溶解性选择）。

仪器方面，分光光度计是核心设备，需具备517nm波长精准输出功能（DPPH的最大吸收峰），建议选择带有恒温槽的型号（控制测定温度）；移液器需校准至±1%误差内，确保加样量准确；涡旋混合器用于样品与DPPH的充分混合，转速≥2000rpm；离心机用于处理浑浊样品，转速≥4000rpm，离心时间5-10分钟以去除沉淀。

需注意，DPPH标准品应密封保存在棕色试剂瓶中，置于4℃冰箱避光保存，避免长期暴露于空气或光照下导致氧化失效；乙醇需提前检查含水量，若水分过高可通过蒸馏法提纯，或直接选用无水乙醇试剂。

样品的前处理流程

样品前处理的目的是提取其中的抗氧化活性成分，确保其与DPPH充分接触。不同形态样品的处理方式不同：液体样品（如果汁、植物提取物溶液）需先经4000rpm离心10分钟，去除果肉残渣或不溶性颗粒，取上清液作为待测液；若样品颜色较深（如蓝莓汁），需适当稀释（1:5或1:10），避免颜色干扰吸光度测定。

固体样品（如果粉、中药饮片）需先粉碎过40目筛，取1g样品加入10mL提取溶剂（如70%乙醇），超声辅助提取30分钟（功率200W，温度40℃），以提高提取效率；提取后同样经4000rpm离心10分钟，取上清液，若上清液仍浑浊可通过0.45μm微孔滤膜过滤，得到澄清待测液。

提取溶剂的选择需遵循“相似相溶”原则：脂溶性抗氧化成分（如维生素E、类胡萝卜素）用无水乙醇或丙酮提取；水溶性成分（如维生素C、多糖）用蒸馏水或50%乙醇提取；若样品含混合活性成分，可采用梯度提取法（先用水提，再用乙醇提），分别测定各相的抗氧化能力。

需注意，提取温度不宜超过50℃，否则易导致热敏性抗氧化成分（如维生素C）分解；提取时间需通过预实验确定，如超声15、30、60分钟后测定提取液的清除率，选择清除率最高的时间作为最佳提取时间。

DPPH工作液的配制与校准

DPPH工作液的浓度直接影响测定结果，需严格按照“母液-工作液”两步法配制。首先制备母液：称取0.00394g DPPH标准品（分子量394.32），用无水乙醇溶解并定容至100mL，得到0.1mmol/L的母液，密封后置于4℃冰箱保存，有效期不超过3天。

临用前需将母液稀释为工作液：取适量母液用无水乙醇稀释，摇匀后在517nm波长下测定吸光度，调整稀释倍数使吸光度达到0.70±0.02（此范围为DPPH的线性反应区间，清除率与吸光度变化呈良好线性关系）。例如，若母液吸光度为1.40，则需稀释2倍，得到吸光度0.70的工作液。

配制工作液时需注意：DPPH易与空气中的氧气反应，稀释过程需快速操作，避免长时间暴露；工作液需现配现用，若放置超过2小时，需重新测定吸光度，若吸光度下降超过0.05，则需重新配制。

测定的具体操作步骤

DPPH测定需设置三组平行实验（空白组、样品组、对照组），以消除背景干扰。具体加样量（以2mL体系为例）如下：空白组：2mL无水乙醇；样品组：1mL待测液+2mL DPPH工作液；对照组：1mL待测液+2mL无水乙醇。

加样顺序需遵循“先加样品，后加DPPH”的原则：先将待测液加入比色管，再加入DPPH工作液，立即用涡旋混合器混合30秒（转速2500rpm），确保样品与DPPH充分接触；对照组则是待测液加乙醇，用于消除样品本身的颜色或浊度对吸光度的影响。

混合后需将比色管置于避光处反应，反应时间根据样品类型确定（如多酚类样品反应30分钟，黄酮类反应45分钟），反应温度控制在25±1℃（可通过恒温箱或恒温水浴实现）。反应结束后，立即用分光光度计测定各组在517nm波长下的吸光度，每个样品测定3次，取平均值。

需注意，比色皿需提前用乙醇清洗并晾干，避免残留水分或杂质影响吸光度；测定前需用空白组调零，确保仪器基线稳定；若样品组吸光度低于0.1（清除率过高），需适当稀释待测液（如1:2或1:5），避免超出线性范围。

吸光度测定的关键参数

分光光度计的参数设置直接影响结果的准确性，需重点关注以下几点：波长选择：固定为517nm（DPPH的特征吸收峰，在此波长下自由基的吸光度变化最明显），若仪器波长偏差超过±1nm，需先校准波长（用汞灯或标准滤光片校准）。

比色皿选择：使用1cm石英比色皿（石英对紫外-可见光的透过率≥90%，而玻璃比色皿在200-400nm波长下有吸收，会干扰测定）；比色皿的光程需一致，若有划痕或污渍，需用乙醇浸泡清洗，或更换新比色皿。

测定模式：选择“单波长测定”模式，每个样品测定3次，取平均值；若仪器有“自动扫描”功能，可先扫描DPPH工作液的吸收光谱，确认最大吸收峰在517nm处，避免因试剂不纯导致峰位移。

需注意，测定过程中应避免强光直射比色皿，否则会加速DPPH分解，导致吸光度下降；若室温波动较大（如超过±2℃），需使用带有恒温槽的分光光度计，保持测定温度稳定。

清除率与抗氧化能力的计算

清除率的计算公式为：清除率（%）= [1-(A样品-A对照) / A空白] × 100%。其中，A样品是样品组的吸光度（样品+DPPH），A对照是对照组的吸光度（样品+乙醇），A空白是空白组的吸光度（乙醇）。该公式通过扣除样品本身的吸光度，消除了颜色或浊度的干扰，使结果更准确。

为了便于不同样品间的比较，通常会将清除率转换为Trolox等价抗氧化能力（TEAC）：先绘制Trolox标准曲线（以Trolox浓度为横坐标，清除率为纵坐标），得到回归方程y = ax + b（R²≥0.99）；然后将样品的清除率代入方程，计算出相当于多少μmol Trolox/g样品（固体）或μmol Trolox/mL样品（液体）。

例如，若Trolox标准曲线的回归方程为y = 0.5x + 0.02（R²=0.995），某样品的清除率为50%，则TEAC = (50-0.02)/0.5 = 99.96μmol Trolox/g样品。TEAC值越高，说明样品的抗氧化能力越强。

需注意，计算前需确保A样品-A对照 < A空白（否则清除率会出现负数，说明样品无抗氧化能力或干扰测定）；若出现负数，需检查样品是否变质，或重新处理样品（如稀释、更换提取溶剂）。

影响结果的关键因素及控制

反应时间是影响清除率的重要因素：不同样品的抗氧化成分与DPPH的反应速率不同，需通过预实验确定最佳反应时间。例如，维生素C与DPPH的反应速率快，15分钟即可达到平衡；而茶多酚与DPPH的反应较慢，需30分钟才能达到平衡。预实验方法：取样品溶液与DPPH工作液混合后，每隔5分钟测定一次吸光度，直到吸光度变化小于0.01（即达到平衡），此时的时间即为最佳反应时间。

温度的影响：DPPH的稳定性受温度影响较大，温度升高会加速DPPH分解（如30℃下DPPH的半衰期为2小时，而25℃下为4小时），导致吸光度下降；温度过低则会减慢反应速率，使清除率偏低。因此，反应温度需控制在25±1℃，可通过恒温箱或恒温水浴实现。

溶剂的影响：DPPH仅溶于有机溶剂（如乙醇、甲醇），若样品用蒸馏水提取，需将DPPH工作液用50%乙醇稀释（提高DPPH在水中的溶解度）；若溶剂中水分含量过高（如超过20%），会导致DPPH聚集沉淀，影响测定结果。因此，溶剂的选择需兼顾DPPH的溶解度和样品的提取效率。

常见问题及解决方法

问题1：样品组吸光度比空白组高（清除率为负数）。原因：样品本身有颜色（如深色果汁），或样品中的成分（如某些多糖）与DPPH反应生成了更强的吸光物质。解决方法：增加对照组（样品+乙醇），扣除样品本身的吸光度；若仍有负数，需稀释样品（1:5或1:10），降低样品颜色的影响。

问题2：清除率重复性差（RSD>5%）。原因：加样不准确（移液器未校准）、涡旋不充分（混合不均匀）、反应时间不一致（有的样品反应30分钟，有的反应25分钟）。解决方法：校准移液器（用天平称量移液器的加样量，误差≤1%）；涡旋混合时间延长至60秒（确保混合均匀）；用计时器控制反应时间，确保每个样品的反应时间一致。

问题3：DPPH工作液吸光度无法调整至0.70±0.02。原因：母液浓度不准确（称量误差）、乙醇含水量过高（DPPH溶解度下降）。解决方法：重新称量DPPH标准品（用分析天平，精度0.1mg）；更换无水乙醇（水分含量≤0.1%），重新配制母液。

问题4：TEAC值偏低。原因：提取效率低（抗氧化成分未充分提取）、反应时间不足（未达到平衡）、溶剂选择不当（抗氧化成分未溶解）。解决方法：优化提取条件（延长超声时间、提高提取温度）；调整反应时间（通过预实验确定最佳时间）；更换提取溶剂（如用70%乙醇代替蒸馏水）。