食品微生物限度检测中大肠埃希菌检查的操作规范

大肠埃希菌是食品中粪便污染的核心指示菌，其检出结果直接关联食品受肠道致病菌污染的风险等级。在食品微生物限度检测中，大肠埃希菌检查的操作规范是确保结果精准、可靠的基石——从样品采集到结果判定的每一步偏差，都可能导致误判，影响食品卫生质量评估与安全监管的有效性。因此，严格遵循标准化操作流程，对关键环节进行精准管控，是为食品安全性提供科学依据的核心前提。

样品采集与保存的无菌操作要求

样品采集是检测的第一步，需保证代表性与无菌性。固体食品（如糕点、肉类）应采用“多点采样法”：从不同部位（表面、内部）取至少5个点，共25g，装入无菌塑料袋；液体食品（如饮料、牛奶）需充分摇匀后，用无菌吸管取25mL至无菌容器；半固体食品（如酱类）用无菌勺子挖取深层样品，避免表面污染。

采集后的样品需立即密封，避免与空气接触。保存温度需控制在4℃以下（如冰盒冷藏），防止微生物繁殖；运输过程中需用冰袋维持低温，且总保存时间不超过24小时——若超过时限，微生物活性会下降，导致检测结果假阴性。

需特别注意：采集工具（如镊子、勺子）需经121℃高压灭菌15分钟，使用前用75%乙醇擦拭，避免引入外源菌；采样人员需戴无菌手套，操作时避免说话、打喷嚏，减少人为污染。

样品制备的标准化流程

样品制备的核心是“均质与稀释”，目的是将样品中的微生物均匀分散，便于后续接种。固体样品需取25g，加入225mL无菌稀释液（首选0.85%生理盐水或0.1%蛋白胨水，后者更易保持微生物活性），放入均质袋中；用拍击式均质器以8000-10000rpm的速度均质1-2分钟，确保样品完全破碎。

液体样品需取25mL，直接加入225mL稀释液，轻轻颠倒摇匀；半固体样品（如酸奶）则用无菌吸管吸取25g，加入稀释液后搅拌均匀。均质后的样品需在15分钟内完成接种——若放置过久，稀释液中的微生物可能因渗透压变化或营养不足死亡。

交叉污染防控是关键：均质袋需一次性使用；均质器每次使用后，需用75%乙醇擦拭表面，再用紫外线照射30分钟；不同样品的均质操作需间隔进行，避免残留样品污染下一个样品。

增菌培养的关键控制要点

增菌的目的是让大肠埃希菌大量繁殖，便于后续分离。选用“乳糖胆盐发酵培养基”（LST）——其中乳糖是碳源，胆盐抑制革兰阳性菌生长，溴甲酚紫是pH指示剂（酸性变黄色）。

接种时需遵循“梯度原则”：取10mL样品匀液接种到双料LST培养基（含双倍营养，适合高浓度样品），1mL接种到单料LST，0.1mL接种到单料LST（分别对应1:10、1:100、1:1000稀释度）。每管接种后需轻轻摇匀，避免气泡影响培养。

培养条件需严格控制：将接种后的LST管放入36℃±1℃的恒温培养箱，培养24小时±2小时。培养期间需每天观察2次——若管内出现气泡（气体来自乳糖发酵），则说明有大肠埃希菌或其他发酵乳糖的菌存在；若24小时无气泡，需延长培养至48小时，仍无气泡则判定为“不产气”，终止该管后续操作。

分离纯化的操作细节

分离的目的是从增菌液中获得大肠埃希菌的单菌落，需用“伊红美蓝琼脂（EMB）”或“SS琼脂”——EMB中的伊红和美蓝可抑制革兰阳性菌，大肠埃希菌发酵乳糖会产生酸，使菌落呈现“紫黑色、有金属光泽”（典型特征）；SS琼脂则更适合分离肠道致病菌，大肠埃希菌菌落为粉红色、圆形。

操作时，用无菌接种环从产气的LST管中取一环培养物（约1μL），在EMB平板上进行“分区划线”：第一区划3-5条平行线，灼烧接种环冷却后，从第一区末端挑取少量细菌，划第二区（与第一区交叉），依次划第三、四区，确保单菌落形成。

划线后的平板需倒置培养（避免冷凝水冲刷菌落），36℃±1℃培养18-24小时。培养后观察菌落：典型大肠埃希菌菌落是“紫黑色、圆形、边缘整齐，有金属光泽”；非典型菌落（如粉红色、无光泽）需标记，后续做生化鉴定。

鉴定试验的方法与判定

鉴定是确认“可疑菌落是否为大肠埃希菌”的关键，需结合“生化试验”与“血清学试验”。

生化试验首选“IMViC试验”（吲哚、甲基红、V-P、柠檬酸盐）：①吲哚试验：取可疑菌落接种到蛋白胨水培养基，培养24小时后，加2滴靛基质试剂，若变红色则为阳性（大肠埃希菌能分解色氨酸产生吲哚）；②甲基红试验：接种到葡萄糖蛋白胨水培养基，培养24小时后加甲基红试剂，变红色为阳性（大肠埃希菌发酵葡萄糖产酸多）；③V-P试验：同一份葡萄糖蛋白胨水培养物，加V-P试剂（α-萘酚+KOH），37℃放置30分钟，不变红为阴性（大肠埃希菌不产生乙酰甲基甲醇）；④柠檬酸盐试验：接种到柠檬酸盐培养基，培养48小时，培养基不变蓝为阴性（大肠埃希菌不能利用柠檬酸盐作为唯一碳源）。大肠埃希菌的IMViC结果应为“++--”（吲哚+、甲基红+、V-P-、柠檬酸盐-）。

血清学试验用于确认血清型（如O157:H7）：取可疑菌落涂在玻片上，加一滴大肠埃希菌诊断血清，轻轻摇匀——若出现凝集（颗粒状沉淀），则为阳性；若不凝集，需用生理盐水做对照（排除自凝）。

补充试验：氧化酶试验（阴性，大肠埃希菌无氧化酶）、动力试验（阳性，有鞭毛能运动），可进一步排除其他菌（如肺炎克雷伯菌IMViC结果为--++，易混淆）。

结果判断的严谨性要求

结果判断需结合“菌落特征+生化反应+血清学试验”，避免误判。

阳性结果：若分离到的菌落符合EMB典型特征（紫黑色有金属光泽），IMViC结果为++--，且血清学试验阳性，则判定“样品中检出大肠埃希菌”。需记录菌落数量：如1:10稀释度的LST管产气，EMB平板上有5个典型菌落，则结果为“50CFU/g（mL）”（5×10）。

阴性结果：若所有LST管均不产气，或分离到的菌落IMViC结果不符合++--，则判定“未检出大肠埃希菌”。需注意：若LST管产气但EMB平板无典型菌落，需重新接种——可能是增菌液中的其他菌（如肠球菌）产气，需进一步鉴定。

可疑情况处理：若IMViC结果为“+/-+--”（如吲哚弱阳性），需重新挑取菌落做生化试验；若血清学试验阴性但生化符合，需考虑非典型血清型，可送实验室做基因测序（如16S rRNA）确认。

试剂与设备的质量管控

试剂与设备是检测的基础，需严格质量控制。

培养基质量：购买有资质的厂家产品（如BD、OXOID），检查批号、有效期（培养基有效期一般为12个月）；使用前需做“无菌试验”（取10mL培养基培养24小时，无细菌生长则合格）和“性能试验”（接种已知大肠埃希菌菌株，若能正常生长则合格）。

设备校准：培养箱需每天用温度计校准温度（误差≤±1℃），每月用温度记录仪记录24小时温度曲线；均质器需定期检查转速（用转速计测试）；pH计需用标准缓冲液（pH4.0、7.0、10.0）校准，确保培养基pH符合要求（LST pH7.4±0.2）。

试剂管理：诊断血清需保存在4℃冰箱，避免反复冻融；靛基质试剂、甲基红试剂需避光保存（防止失效）；无菌稀释液需现配现用，或灭菌后保存不超过7天。