生物制品微生物限度检测中控制菌检查的操作要点

生物制品作为用于预防、治疗或诊断的特殊药品，其微生物安全性直接关系到使用者健康。控制菌检查是生物制品微生物限度检测的核心环节，旨在检出大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌等致病性微生物，防止不合格产品流入市场。操作要点的规范性直接影响结果准确性——任何环节疏漏都可能导致假阳性或假阴性，进而影响产品安全评估。本文结合《中国药典》标准，梳理控制菌检查的关键操作要点，为实验室实践提供参考。

样品处理的操作要点

样品处理的核心是“去除抑菌成分+分散微生物”。液体制品（如疫苗）需梯度稀释：取10ml样品加90ml灭菌生理盐水制成1:10稀释液，含青霉素的制品需加青霉素酶（每ml加100-1000U）中和抑菌作用；固体制品（如冻干粉）需均质处理：用无菌研磨器将样品与生理盐水混合成混悬液，确保微生物充分分散；含强抑菌成分的制品用薄膜过滤法：通过0.45μm滤膜截留微生物，用100ml生理盐水冲洗3次去除抑菌剂，再将滤膜贴于培养基。

处理前需验证方法有效性：将标准菌株（如大肠埃希菌ATCC25922）加入样品，处理后培养，回收率需≥70%——若回收率低，说明抑菌成分未完全去除或微生物分散不充分，需调整稀释倍数或中和剂用量。

操作细节需注意：取固体制品混悬液时要取上清液（避免颗粒干扰），滤膜取出时夹边缘（不接触表面），确保微生物与培养基完全接触。

培养基的选择与适用性验证

控制菌检查需用选择性和鉴别培养基：大肠埃希菌用麦康凯琼脂（胆盐抑制革兰阳性菌，乳糖发酵显粉红色），金黄色葡萄球菌用甘露醇氯化钠琼脂（甘露醇发酵显黄色），沙门菌用SS琼脂（枸橼酸盐抑制杂菌，无色菌落为可疑）。

培养基需做适用性验证：促生长试验——将标准菌株（10-100CFU）接种培养基，37℃培养24小时，需生长旺盛并形成典型菌落；抑制试验——将非目标菌（如枯草芽孢杆菌）接种，需无生长或生长微弱。例如麦康凯琼脂需促进大肠埃希菌生长，同时抑制枯草芽孢杆菌。

培养基制备需注意：加热溶解时避免过度煮沸（破坏营养），灭菌后快速冷却至45℃倒平板（防止凝固不均匀）；储存时密封防潮，使用前检查外观（无浑浊、变色）。

阳性与阴性对照的设置要点

对照试验是验证方法有效性的关键。阳性对照需用对应标准菌株：检查大肠埃希菌时，取10-100CFU的大肠埃希菌ATCC25922加入灭菌生理盐水，按样品流程处理——阳性对照必须生长，否则方法无效（如培养基失效），需重做。

阴性对照用灭菌生理盐水代替样品：按相同流程操作，需无任何生长——若有生长，说明环境或试剂污染，结果不可靠。

对照需与样品同步进行：用相同批次培养基、耗材和仪器，确保条件一致。例如样品用薄膜过滤法，阳性对照也需用同型号滤膜、相同冲洗液，避免因条件差异导致对照异常。

接种与培养条件的控制

接种需严格无菌操作：在生物安全柜中进行，操作前用75%乙醇消毒台面和双手，接种环灼烧至红热（冷却30秒再用）。液体制品取1ml稀释液接种增菌肉汤，固体制品取上清液接种，薄膜过滤法则将滤膜贴于培养基（无气泡）。

培养条件需匹配目标菌特性：温度——大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌需35-37℃，沙门菌同此温度；时间——增菌培养18-24小时（如沙门菌的亚硒酸盐增菌液），选择性培养24-48小时（如麦康凯琼脂培养48小时观察典型菌落）。

培养箱需稳定：温度波动≤±1℃，每天记录两次温度；平板倒置培养（防止冷凝水冲散菌落），例如麦康凯琼脂倒置培养可避免粉红色菌落扩散。

分离培养与鉴定的关键步骤

分离培养需获得单菌落：增菌液取1ml涂布于选择性培养基，螺旋式涂布确保均匀，培养后挑取典型菌落——大肠埃希菌在麦康凯上是粉红色圆形菌落，金黄色葡萄球菌在甘露醇琼脂上是黄色凸起菌落，沙门菌在SS琼脂上是无色透明菌落。

鉴定需结合生化与血清学试验：大肠埃希菌做IMViC试验（靛基质+、甲基红+、VP-、枸橼酸盐-），金黄色葡萄球菌做血浆凝固酶试验（阳性），沙门菌做硫化氢试验（阳性）和血清凝集试验（O抗原、H抗原阳性）。

鉴定细节需注意：挑取菌落时轻触表面（不刮培养基），生化试剂用新鲜品（如蛋白胨水需24小时内使用，避免色氨酸分解导致靛基质假阴性）。

结果判断的逻辑要点

结果判断遵循“先对照后样品”：先看阳性对照——必须生长且符合特征，否则方法无效；再看阴性对照——必须无菌生长，否则污染，结果作废；最后看样品——有典型菌落且鉴定符合，则阳性；无典型菌落或鉴定不符，则阴性。

若样品增菌液浑浊但选择性培养基无典型菌落，需延长培养至48小时，或更换培养基（如用伊红美蓝琼脂代替麦康凯）。例如某些大肠埃希菌在麦康凯上生长慢，24小时无典型菌落，48小时后才出现粉红色。

结果需记录细节：菌落形态（大小、颜色）、生化结果（+/-）、血清学结果（凝集/不凝集），便于追溯。

污染控制的核心措施

环境控制：操作在二级生物安全柜中进行，每6个月检测高效过滤器（无泄漏）、气流速度（0.38-0.51m/s）；操作前紫外消毒30分钟，避免打开玻璃门。

试剂与耗材控制：培养基、稀释液121℃灭菌15分钟，使用前查外观；滤膜、镊子用一次性灭菌品，中和剂、血清4℃储存，用前查变质（如血清浑浊）。

操作控制：戴无菌手套（每样品换一次），避免说话咳嗽，接种环灼烧灭菌，样品瓶开口用乙醇消毒。环境监测每月一次：空气沉降菌≤10CFU/皿，表面微生物≤5CFU/100cm²，手微生物≤10CFU/手。

人员操作的规范性要求

人员需定期培训：熟悉无菌技术、控制菌形态与生化特性、SOP流程（如稀释倍数、培养时间），考核合格后方可独立操作。

操作时专注：不同样品间用乙醇消毒手套，避免交叉污染；挑取菌落轻触表面，接种时沿管壁加样（无气泡）；中途离开需关闭安全柜，回来重新消毒。

问题排查能力：若阳性对照不生长，需检查培养基灭菌记录、接种量、培养温度；若阴性对照生长，需查培养基、耗材或环境是否污染。