微生物限度检测中阳性对照菌株的传代与保存管理

微生物限度检测是药品、食品、化妆品等产品质量控制的关键环节，其结果可靠性直接依赖阳性对照试验的有效性。阳性对照菌株作为验证检测方法灵敏度与准确性的“金标准”，其活性与特性的稳定保持，离不开科学的传代与保存管理。然而实际操作中，因传代过度、保存不当导致菌株变异、污染的问题时有发生，不仅影响检测结果可信度，还可能引发质量风险。本文结合实验室实操经验，详细解析阳性对照菌株传代与保存的核心要点，为规范管理提供具体指南。

阳性对照菌株的基础认知

阳性对照菌株是已知特性、纯度符合要求，用于验证微生物限度检测方法有效性的标准菌株。其核心作用是“验证方法能否检出目标微生物”——比如检测样品中大肠杆菌时，需同步接种大肠杆菌阳性对照；若对照管生长良好而样品管未生长，说明方法有效；若对照管不生长，则检测结果不可信。

常用菌株包括大肠杆菌（CMCC 44102）、金黄色葡萄球菌（CMCC 26003）、枯草芽孢杆菌（CMCC 63501）、白色念珠菌（CMCC 98001）等，均需来自中国微生物菌种保藏管理委员会等认可机构，确保溯源性。

需注意的是，菌株生物学特性（如菌落形态、生化反应）会随传代次数增加变异，因此必须通过严格管理将风险降至最低——一般传代数不超过5代（从原始菌株计）。

传代操作的核心原则与步骤

传代目的是保持菌株活性与特性，但过度传代易导致变异，因此需遵循“最少传代”原则：仅当菌株活性下降或需使用时传代，每代需记录传代数（如原始为0代，首次传代为1代）。

具体步骤分四步：一是复苏——从冷冻管取少量菌液，划线接种至营养琼脂斜面；二是培养——按菌株适宜条件培养（如细菌37℃18-24小时、真菌25℃48小时）；三是转接——挑取单菌落（确保纯度）接种至新斜面；四是标记——在试管上标注菌株名、传代数、日期、操作者，例如“大肠杆菌CMCC 44102，第3代，20240510，李华”。

关键细节：必须挑取单菌落转接，若直接取混合菌苔，易导致菌株纯度下降；接种环需灼烧至红热，冷却后使用，避免烫死菌株。

传代过程中的污染防控要点

污染是传代最常见风险，防控核心是“无菌操作”，具体包括：

环境控制：传代需在超净工作台内进行，操作前紫外消毒30分钟，用75%乙醇擦台面；需验证工作台风速（0.36-0.54m/s）与洁净度（百级标准），确保空气过滤有效。

工具灭菌：接种环、针需灼烧至红热；吸管、离心管需121℃高压20分钟；培养基灭菌后检查澄明度（无浑浊）。

操作规范：戴无菌手套，手消后操作；试管塞打开时需在火焰上灼烧3秒（杀灭管口微生物）；避免接种环接触试管外壁；操作中禁止说话、触摸面部。

交叉污染预防：不同菌株分开操作，换接种环或乙醇消毒；斜面直立放置，避免菌液流至管口。

保存方法的选择逻辑与适用场景

保存需“减缓代谢活动”，延长寿命并保特性，常用三种方法需按保存期与使用频率选：

斜面保存：接种至营养琼脂斜面，4℃冰箱保存1-3个月。优点是操作简单、取用方便，适合日常频繁使用的菌株（如大肠杆菌）；缺点是需定期传代。

冷冻保存：将菌悬于10%-20%甘油生理盐水，分装冻存管，-20℃（短期）或-80℃（长期）保存1-5年。优点是保存久、变异低，适合储备菌株（如原始菌株）；缺点是需特殊设备，复苏需快速解冻。

液氮保存：-196℃保存10年以上，适合珍贵菌株，但设备成本高，一般实验室少用。

冷冻保存的关键技术细节

冷冻效果取决于“保护剂”与“冻融速度”：

保护剂制备：甘油用生理盐水稀释至10%-20%（过低无法保护、过高致细胞脱水）；DMSO浓度5%-10%，但部分真菌对其敏感，需提前测试。

菌液制备：挑单菌落至液体培养基，培养至对数生长期（OD600=0.6-0.8，活性最强），与保护剂1:1混合，确保浓度10^7-10^8 CFU/mL（过低易复苏失败）。

冻存过程：需梯度降温——先-20℃1小时，再转-80℃，避免直接放-80℃（冰晶刺破细胞）；冻存管需密封，防止甘油泄漏。

复苏方法：从-80℃取管，立即放37℃水浴1-2分钟融化（避免反复冻融），解冻后立即接种斜面，培养24小时检查生长情况。

斜面保存的日常管理要点

斜面是实验室最常用方法，但易因管理不当出问题，需注意：

培养基质量：斜面需新鲜（制备后1周内用），pH符合菌株要求（细菌7.0-7.4、真菌5.5-6.0）；若斜面干裂、褪色或浑浊，需丢弃重制。

保存条件：放4℃冰箱上层（温度稳定），避免靠近门（温度波动）；用黑布遮挡，避免光照（如枯草芽孢杆菌对光敏感）。

定期检查：每周查一次斜面，看是否有杂菌（不同形态菌落、黏液）或老化（菌落干燥、颜色变浅）；异常则丢弃，启用备用菌株。

传代控制：斜面菌株传代不超5代，超后需从原始冷冻株复苏，避免变异。

菌株身份确认的常规流程

定期确认身份是保特性关键，流程分三步：

形态学检查：看菌落形态（大肠杆菌圆形光滑乳白、金葡菌圆形凸起金黄）与细胞形态（革兰染色——大肠杆菌阴性短杆菌、金葡菌阳性球菌）。

生化反应验证：用生化试验确认代谢特性，如大肠杆菌发酵乳糖（产酸产气）、金葡菌产凝固酶（凝血浆）。

分子鉴定：对重要或异常菌株，用16S rRNA测序，序列与NCBI数据库比对，确认种属。

确认频率：每传代2次或保存6个月全面确认；关键检测用菌株（如药品无菌检查），每次传代后需查形态与生化。

异常情况的处理策略

实操中遇异常需及时处理：

菌株不生长：若复苏后无菌落，可能冻存管破裂、复苏温度错（如真菌用37℃）或培养基失效。处理：查冻存管完整性，换培养基，复苏原始株。

杂菌污染：斜面出现杂菌，立即丢弃，用75%乙醇擦超净台、紫外照1小时；查其他菌株是否污染，必要时做环境沉降菌检测。

特性改变：若大肠杆菌不能发酵乳糖，需停止使用，启用备用株，回顾传代过程（如是否超5代、保存温度高）。

标签模糊：试管标记不清（如传代数看不到），立即丢弃——无法追溯历史的菌株存在变异风险；后续用耐低温标签（如冻存管专用）。