口腔含漱液抗菌功效性验证的抑菌圈直径测定标准解读

口腔含漱液的抗菌功效是其核心卖点之一，而抑菌圈直径测定法作为体外验证的经典方法，能直观反映产品对致病菌的抑制能力。该方法的结果可靠性高度依赖标准执行的严谨性——从菌株选择到操作细节，每一步偏差都可能导致功效判定错误。本文结合《口腔护理产品抗菌性能测试方法》（QB/T 5514-2020）、《消毒技术规范》（2002版）等标准，系统解读抑菌圈直径测定的关键规则，帮助企业与检测机构规避实操误区，确保结果真实有效。

抑菌圈法的原理与适用边界

抑菌圈直径测定的核心是“扩散-抑制”逻辑：将含漱液注入琼脂平板上的牛津杯，抗菌成分随培养基水分向周围扩散，形成浓度梯度。当成分浓度达到菌株的最低抑菌浓度（MIC）时，会阻止菌株生长，形成圆形透明圈（抑菌圈）。圈的大小与抗菌成分的活性、扩散能力正相关——活性越强、扩散越快，抑菌圈越大。

该方法适用于液态含漱液（如清爽型、浓缩型），但不适用含不溶性颗粒（如二氧化硅摩擦剂）或高粘度（如含大量甘油）的产品：颗粒会阻塞牛津杯，干扰扩散；高粘度会减缓成分扩散，导致抑菌圈偏小，需先通过离心（3000rpm，5分钟）或过滤（0.22μm滤膜）预处理。

另外，抑菌圈法仅验证“抑菌”（抑制细菌生长），无法验证“杀菌”（杀死细菌）——若产品宣称“杀菌”，需补充悬液定量杀菌试验，两者结合才能完整支撑功效宣称。

试验菌株的标准选择规则

标准菌株的选择需匹配“口腔场景”：优先选择口腔常见致病菌，具体包括三类：

1、革兰阳性菌：金黄色葡萄球菌（ATCC 29213，致口腔溃疡）、变异链球菌（ATCC 25175，致龋）；

2、革兰阴性菌：大肠杆菌（ATCC 25922，致牙龈炎症）、铜绿假单胞菌（ATCC 27853，机会性感染）；

3、真菌：白色念珠菌（ATCC 10231，致鹅口疮）。

菌株来源必须合规——需使用国家认可的标准菌株库（如CMCC、ATCC）的冻干粉，不得使用实验室传代超过5次的菌株（传代过多会导致菌株变异，降低抗菌敏感性）。活化时，冻干粉需用营养肉汤复溶，37℃培养16-18小时至对数生长期（此时菌株活性最强），再调整至0.5麦氏浊度（约1.5×10⁸ CFU/mL）——这一浓度是“黄金接种量”，过高会让菌株竞争抑制抑菌成分，过低则会放大抑菌效果。

培养基与试剂的制备细节

培养基需“因材施教”：细菌用Mueller-Hinton（MH）琼脂（pH 7.2-7.4），真菌用沙堡弱葡萄糖琼脂（SDA，pH 5.6）。MH琼脂的优势是成分稳定（含酪蛋白水解物、淀粉），能避免某些抗菌成分（如四环素）的钝化；SDA则为真菌提供酸性生长环境，模拟口腔黏膜的弱酸性（pH 6.5左右）。

培养基制备需严格控温：MH琼脂高压灭菌（121℃，15分钟）后，冷却至45-50℃（不烫手）再倒平板——温度过高会杀死后续接种的菌株，过低会导致琼脂凝固不均（表面有波纹）。每平板倒20mL，厚度控制在4mm±0.5mm：太薄（<3mm）会让抗菌成分扩散过快，抑菌圈偏大；太厚（>5mm）则扩散过慢，圈偏小。

试剂的“无菌性”是关键：牛津杯（内径6mm、外径8mm）需提前高压灭菌（121℃，20分钟），避免残留抗菌成分；加样器（200μL）需校准（误差≤1%），确保每杯加样量一致——加样量差10μL，抑菌圈可能差1-2mm。

操作步骤的“毫米级”控制

平板涂布是基础：用无菌棉拭子蘸取0.5麦氏浊度菌液，挤去多余液体（棉拭子不滴水），以“Z”字形涂布平板，旋转120°再涂一次，重复三次——确保菌液均匀覆盖（若涂布不均，会出现“局部菌落过密”，导致抑菌圈边缘不圆）。涂布后倒扣放置10分钟，让菌液完全吸收（避免牛津杯滑动）。

牛津杯放置需“精准定位”：用镊子垂直放在平板上，间距≥24mm（避免相邻抑菌圈重叠），离边缘≥15mm（避免边缘效应——平板边缘的琼脂易干燥，扩散速度快，圈会偏大）。每杯加200μL含漱液，加样时缓慢注入（避免溢出），加完静置15分钟（让抗菌成分初步扩散），再倒置培养（37℃，细菌16-18小时，真菌24小时）。

培养时间不能“偷工减料”：细菌培养16小时是临界点——此时抑菌圈刚形成，边界清晰；超过18小时，细菌会过度生长，掩盖圈的边缘（尤其是白色念珠菌，24小时后菌落会蔓延至抑菌圈内部）。

抑菌圈测量的“精度要求”

测量工具需“专业”：用精度0.1mm的游标卡尺或自动抑菌圈测量仪（后者更准确，能避免人为视差）。测量时，平板放在黑色背景上（增强对比度），测最大直径与最小直径的平均值——若抑菌圈边缘有零星菌落（涂布不均导致），需忽略这些区域，测正常边界。

带色含漱液需“脱色处理”：如蓝莓味含漱液会让平板染蓝，掩盖抑菌圈。此时需用75%乙醇冲洗平板表面（轻轻擦，避免破坏琼脂），脱色后再测量——乙醇不会影响抑菌圈的大小，只会去除表面色素。

结果需“重复验证”：标准要求至少做3次独立试验（每次用新平板、新菌液），三次结果的相对标准偏差（RSD）≤5%（如三次结果为15.2mm、15.5mm、15.3mm，RSD=0.8%，符合要求）。若某一次结果偏差超过2mm（如15.2mm、17.5mm、15.3mm），需重新试验，排除操作误差（如加样量不准、牛津杯移动）。

功效判定的“阈值规则”

不同菌株的“敏感阈值”是功效判定的核心，标准中明确规定：

1、金黄色葡萄球菌/大肠杆菌：抑菌圈≥15mm为“敏感”（强抑制），10-14mm为“中度敏感”，<10mm为“不敏感”；

2、白色念珠菌：≥12mm为“敏感”（真菌细胞壁厚，对抑菌成分更耐受）；

3、变异链球菌（致龋菌）：≥14mm为“敏感”（模拟口腔致龋环境的特殊要求）。

举个例子：某含氯己定（0.1%）的含漱液，若对金黄色葡萄球菌的抑菌圈是16mm，符合“敏感”要求，可宣称“抑制金黄色葡萄球菌”；若对白色念珠菌的圈是11mm，则不符合“敏感”，不能宣称“抑制白色念珠菌”。

常见误区的“避坑指南”

误区1：用“过期培养基”——MH琼脂开封后若未密封，会吸潮结块，导致抗菌成分扩散变慢，抑菌圈偏小。解决：培养基需在保质期内使用，开封后用封口膜密封，冰箱（4℃）保存。

误区2：加样后“立即培养”——未静置会让抗菌成分未扩散就被琼脂吸收，圈变小。解决：加样后静置15-20分钟，再放入培养箱。

误区3：测量时“包含牛津杯内径”——部分人会把牛津杯的6mm算进抑菌圈，导致结果偏大（如实际圈是15mm，算上内径变成21mm）。正确：从透明圈的边缘开始测量，不含牛津杯。

误区4：忽略“含漱液pH”——若含漱液pH<5或>9，会破坏琼脂结构（pH<5会让琼脂水解，pH>9会让琼脂无法凝固），或抑制菌株生长（如大肠杆菌在pH<4时无法生长）。解决：测试前调整含漱液pH至6-8（用1mol/L NaOH或HCl），再进行试验。