保健品微生物限度检测中控制菌检查的阳性对照设置

在保健品微生物限度检测中，控制菌检查是评估产品安全性的核心环节，而阳性对照设置则是验证检测方法有效性、杜绝假阴性结果的关键保障。阳性对照通过引入已知标准菌株，模拟目标菌在检测流程中的生长过程，直接反映培养基、试剂、操作及环境是否符合要求。本文结合法规要求与实验室实操经验，系统解析控制菌检查中阳性对照的设置要点，助力规范操作、提升检测准确性。

阳性对照设置的法规依据

阳性对照是法规强制要求的“方法验证必备项”。《中国药典》2020版四部“微生物限度检查法”（通则1105）明确规定：“控制菌检查应同时进行阳性对照试验，以确认方法的适用性”；《保健食品检验与评价技术规范（2003版）》也强调，控制菌检测需设置阳性对照，若阳性对照不生长，检测结果无效。这些要求的核心逻辑是：只有阳性对照能生长，才能证明检测系统具备“检出目标菌”的能力——若阳性对照失败，说明方法存在缺陷（如培养基失效、操作错误），此时供试品结果不可信。

例如，检测保健品中的大肠埃希菌时，法规要求阳性对照必须使用大肠埃希菌标准株（如CMCC(B)44102），并遵循与供试品完全一致的处理流程。这并非“形式主义”，而是确保检测结果可靠的底线。

阳性对照菌的选择原则

阳性对照菌需满足“对应性”与“标准性”两大核心要求。首先，菌株必须与目标控制菌“一一对应”：检测金黄色葡萄球菌，就用金黄色葡萄球菌标准株；检测沙门菌，就用沙门菌标准株，不能用其他菌株替代——不同菌株的生长特性差异会导致结果偏差。其次，菌株需来自权威保藏机构，如中国医学微生物菌种保藏中心（CMCC）或美国典型培养物保藏中心（ATCC），确保遗传稳定性与生物学特性一致。

常见控制菌对应的标准株：大肠埃希菌选CMCC(B)44102或ATCC25922；金黄色葡萄球菌选CMCC(B)26003或ATCC29213；沙门菌选CMCC(B)50094或ATCC14028；铜绿假单胞菌选CMCC(B)10104或ATCC27853。需注意，菌株传代次数不得超过5代（从冷冻干燥管复苏后计数）——超过5代的菌株易发生变异，可能丧失典型生长特性。

阳性对照菌液的制备要点

菌液的“新鲜度”与“浓度”是阳性对照成功的关键。首先，复苏菌株：取冻存的标准株，接种至营养肉汤，36℃±1℃培养18-24小时，获得对数生长期的新鲜培养物——此时菌株活力最强，生长最典型。若用老化培养物（如培养超过24小时），菌株会进入衰退期，活力下降，可能导致不生长。

接下来稀释定量：用0.9%无菌氯化钠溶液或磷酸盐缓冲液（PBS）做10倍系列稀释（如10⁻¹至10⁻⁶），然后通过平板计数法验证浓度——需确保每毫升菌液含10-100CFU。这个范围是法规推荐的“最佳区间”：浓度过低易因菌株数量不足不生长，过高则菌落过密难以计数。

菌液需现配现用，若需短期保存（≤24小时），可放4℃冰箱，但使用前需重新混匀并计数——4℃保存的菌液可能因沉淀或死亡导致浓度下降。

阳性对照的加样方式与时机

加样需“模拟供试品流程”，让阳性菌经历与供试品相同的处理（如稀释、过滤、中和），才能真实反映检测系统的有效性。常见加样方式：

（1）液体供试品：将阳性菌液直接加入供试品处理液（如1:10稀释的口服液），混匀后按常规流程检测（如接种平板）。例如，取10ml供试品处理液，加1ml 10-100CFU/ml的大肠埃希菌液，混匀后倒平板。

（2）固体供试品：先将供试品溶解或稀释（如用PBS溶解颗粒剂至1:10），再加入阳性菌液。例如，取10g固体保健品，加90ml PBS制成1:10悬液，取10ml悬液加1ml阳性菌液，混匀后过滤。

（3）薄膜过滤法：供试品过滤后，将阳性菌液加在滤膜上（用少量冲洗液冲洗至滤膜表面），再培养。这种方式能验证滤膜是否影响菌株生长——若滤膜有吸附作用，阳性菌可能无法生长，需更换滤膜或调整冲洗液。

加样时机必须与供试品“同步”：用相同批次的培养基、试剂，在同一环境下操作，避免因时间或试剂差异导致结果偏差。

阳性对照的培养条件控制

培养条件需“精准匹配”目标菌的生长需求，核心参数是温度、时间与培养基。不同控制菌的培养条件差异显著：

（1）大肠埃希菌：用麦康凯琼脂，36℃±1℃培养24-48小时，典型菌落为红色、圆形、凸起。

（2）金黄色葡萄球菌：用甘露醇氯化钠琼脂，36℃±1℃培养24-48小时，典型菌落为黄色、有光泽，周围培养基变黄（分解甘露醇产酸）。

（3）沙门菌：先经SC增菌液36℃培养18-24小时，再转种SS琼脂，36℃培养24-48小时，典型菌落为无色透明、有黑色中心。

培养箱温度需每日校准（误差≤±1℃）：温度过高会热损伤菌株，过低则抑制生长。例如，大肠埃希菌在30℃培养会生长缓慢，40℃以上可能死亡。培养基需检查有效期与质量：若培养基变色、浑浊或凝固不良，需立即更换——劣质培养基是阳性对照不生长的常见原因。

阳性对照的结果判断与异常处理

阳性对照的结果标准很明确：必须生长良好，出现10-100个典型菌落。例如，大肠埃希菌的阳性平板应出现10-100个红色菌落，数量符合、形态典型，说明检测系统有效；若不符合，需立即排查原因：

（1）不生长：排查四大因素——①菌株：是否死亡（冻存不当）、传代过多；②培养基：是否过期、灭菌不彻底；③操作：加样位置错误（如过滤时未加到滤膜上）、浓度过低；④环境：培养箱温度不对、漏温。

（2）菌落过密（＞100CFU）：因菌液浓度过高，需重新稀释至10-100CFU/ml。

（3）非典型菌落：可能因菌株变异或污染，需重新复苏标准株，制备新鲜菌液重试。

需注意，阳性对照异常时，供试品结果无效——必须先解决阳性对照问题，再重测供试品。

阳性对照的操作注意事项

（1）规避抑菌干扰：若保健品含抑菌成分（如酒精、防腐剂），需用中和剂（如聚山梨酯80中和表面活性剂）或稀释法降低抑菌作用。阳性对照需验证中和效果——若加中和剂后阳性菌能生长，说明抑菌作用已克服；若仍不生长，需调整中和剂浓度或稀释倍数。

（2）无菌操作：在超净工作台内操作，戴无菌手套，用无菌器材，避免外源性污染。例如，操作时说话、动作过大，可能引入杂菌，导致阳性对照出现非目标菌落。

（3）空白对照：同时设置空白对照（仅加培养基与稀释液，不加供试品与阳性菌）。空白对照应无菌生长——若有菌落，说明环境或试剂污染，需重新试验。

（4）记录完整：详细记录菌株编号、培养时间、稀释倍数、加样量、培养条件、结果——完整记录是追溯问题的关键，也是法规要求的“可追溯性”体现。