污水排放检测中微生物指标的检测方法有哪些呢

污水排放中的微生物指标直接关联水环境安全与公众健康，常见检测对象包括粪大肠菌群、总大肠菌群、细菌总数、致病性微生物（如沙门氏菌、志贺氏菌）等。准确的检测方法是防控水体污染、保障污水达标排放的关键。本文将系统梳理污水排放检测中微生物指标的主流检测方法，解析其原理、操作要点及适用场景，为环境监测从业者提供实用参考。

传统培养法

传统培养法是微生物指标检测的经典方法，核心原理是基于微生物的生长代谢特性，通过特定培养基提供营养和生长条件，使目标微生物繁殖形成肉眼可见的菌落或产生特征性代谢产物，进而实现定性或定量分析。以细菌总数检测为例，操作流程通常包括：将污水样品梯度稀释后，取适量稀释液接种至营养琼脂培养基平板，37℃恒温培养24-48小时，统计平板上的菌落数量（CFU），再根据稀释倍数计算样品中的细菌总数。

对于大肠菌群这类指示菌，传统培养法常采用“初发酵-平板分离-复发酵”的三步法：初发酵用乳糖胆盐发酵管，观察产酸产气情况；平板分离用伊红美蓝琼脂（EMB），挑取紫黑色带金属光泽的菌落；复发酵再次验证乳糖发酵能力，最终确认大肠菌群存在。

传统培养法的优势在于成本低、操作简单，结果直观易读，适用于细菌总数、总大肠菌群等常规指标的检测。但该方法局限性也较明显：培养周期长（需1-3天），无法检测难培养或非可培养状态的微生物，且对操作人员的微生物学基础要求较高，难以满足快速检测需求。

滤膜法

滤膜法是针对水中微生物的浓缩检测方法，原理是利用微孔滤膜（孔径通常为0.45μm或0.22μm）截留污水中的微生物，再将滤膜转移至选择性培养基上培养，通过菌落计数实现定量。操作步骤大致为：取一定体积的污水样品，通过抽滤装置使样品中的微生物截留在滤膜表面；将滤膜正面朝上贴在含有目标微生物选择性培养基的平板上（如检测粪大肠菌群用MFC培养基），37℃或44.5℃培养18-24小时；统计滤膜上目标菌落的数量，计算单位体积样品中的微生物浓度。

滤膜法的关键在于滤膜的选择和抽滤操作的规范性：滤膜孔径需匹配目标微生物大小（如0.45μm滤膜适用于细菌截留），抽滤时压力要适中，避免滤膜破裂或微生物细胞受损。该方法适用于低浊度、悬浮物少的污水样品（如污水处理厂出水），尤其适合大肠菌群、粪大肠菌群等指标的快速检测。

与传统培养法相比，滤膜法的优势是样品用量大（可过滤100ml甚至更多样品），检测灵敏度更高，且培养时间较短（18-24小时）。但对于高浊度、含大量悬浮物的污水（如工业废水或未经处理的生活污水），滤膜易堵塞，会导致过滤困难或截留效率下降，此时需先对样品进行预处理（如离心、沉淀），或改用其他方法。

多管发酵法

多管发酵法又称最可能数法（MPN法），是用于大肠菌群、粪大肠菌群等指示菌定量检测的经典方法，核心原理是基于统计学中的泊松分布，通过将样品梯度稀释后接种至多个发酵管，根据发酵管的阳性率（产酸产气）查MPN表，计算样品中目标微生物的最可能数量。

以粪大肠菌群检测为例，操作流程为：将污水样品按10倍梯度稀释（通常做3个稀释度，每个稀释度接种5支发酵管），接种至EC肉汤培养基（含胆汁盐，抑制革兰氏阳性菌），44.5℃恒温培养24小时，观察每支发酵管是否产酸（培养基变黄）产气（倒管内有气泡）。根据阳性发酵管数量，查MPN表得到每100ml样品中的粪大肠菌群数。

多管发酵法的优势在于适用于悬浮物多、浊度高的污水样品（如未经处理的生活污水），因为发酵管中的液体培养基能容纳一定量的悬浮物，不会像滤膜法那样因堵塞影响结果。但该方法操作繁琐，需要准备大量发酵管，且结果是统计学估计值，而非精确计数，同时培养时间也较长（24-48小时）。

荧光定量PCR法

荧光定量PCR法（qPCR）是基于分子生物学的快速检测方法，原理是利用DNA聚合酶的扩增作用，对目标微生物的特异性基因（如沙门氏菌的invA基因、大肠菌群的lacZ基因）进行体外扩增，同时通过荧光探针或染料（如SYBR Green）实时监测扩增过程中荧光信号的变化，根据荧光阈值（CT值）与标准曲线的对应关系，实现目标微生物的定量分析。

在污水检测中，qPCR法的操作步骤主要包括：首先从污水样品中提取微生物总DNA（需注意去除样品中的PCR抑制物，如腐殖酸、重金属离子，常用磁珠法或柱式提取试剂盒）；然后配制PCR反应体系（包含引物、探针、DNA模板、Taq酶等）；将反应体系放入荧光定量PCR仪，设置扩增程序（通常为95℃预变性5分钟，然后95℃变性15秒、60℃退火延伸30秒，循环40次）；最后通过仪器软件分析CT值，结合标准曲线计算样品中目标微生物的浓度。

qPCR法的最大优势是快速（整个过程约3-6小时）、灵敏度高（可检测到10CFU/ml以下的微生物）、特异性强（通过引物探针设计靶向特定基因，避免交叉反应），适用于致病性微生物（如沙门氏菌、志贺氏菌、肠出血性大肠杆菌O157:H7）的快速检测，尤其适合突发环境事件中的应急监测。但该方法成本较高（需要荧光定量PCR仪、试剂盒），且对样品前处理要求严格，若污水中的抑制物未完全去除，会导致扩增失败或结果偏差。

酶联免疫吸附法（ELISA）

酶联免疫吸附法（ELISA）是基于抗原-抗体特异性结合的免疫检测技术，原理是将目标微生物的特异性抗体包被在酶标板上，加入污水样品后，样品中的目标抗原（如致病菌的表面蛋白、毒素）与抗体结合，再加入酶标记的二抗（与目标抗原结合），最后加入酶的底物（如TMB），酶催化底物产生颜色反应，通过酶标仪测定吸光度值，根据标准曲线计算目标抗原的浓度，间接反映目标微生物的存在及数量。

在污水检测中，ELISA法常用于致病性微生物毒素（如霍乱弧菌的霍乱毒素、金黄色葡萄球菌的肠毒素）或特异性抗原的检测。操作流程大致为：①包被：将抗目标抗原的单克隆抗体稀释后加入酶标板孔，4℃过夜包被；②封闭：用牛血清白蛋白（BSA）封闭未结合的位点，防止非特异性结合；③加样：加入处理后的污水样品（需离心去除悬浮物，或用滤膜浓缩目标微生物），37℃孵育1小时；④加酶标抗体：加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗，37℃孵育1小时；⑤显色：加入TMB底物，室温避光孵育15分钟；⑥终止：加入硫酸终止反应；⑦读数：用酶标仪在450nm波长下测定吸光度值。

ELISA法的优势在于快速（约2-4小时）、高通量（一次可检测96个样品）、操作相对简单，不需要复杂的分子生物学设备，适用于批量样品的筛查。但该方法的局限性在于：只能检测具有抗原性的目标物，无法区分活的和死的微生物；抗体的特异性直接影响结果准确性，若存在交叉反应（如与其他类似微生物的抗原结合），易导致假阳性；此外，污水中的悬浮物、蛋白类物质可能干扰抗原-抗体结合，需要严格的样品前处理。

ATP生物发光法

ATP生物发光法是基于微生物细胞内ATP（三磷酸腺苷）含量的快速检测方法，原理是：ATP是所有活细胞的能量载体，荧光素酶在镁离子、氧气存在下，能催化荧光素与ATP反应，产生可见光（波长约560nm），光的强度与样品中的ATP含量成正比，而ATP含量又与活微生物数量呈正相关，因此可通过检测光强间接定量活微生物。

在污水检测中，ATP生物发光法的操作非常简便：取一定体积的污水样品，加入细胞裂解液（破坏微生物细胞膜，释放 intracellular ATP），混匀后加入ATP检测试剂（含荧光素、荧光素酶），立即用 luminometer（ luminometer）测定相对光单位（RLU），再通过标准曲线将RLU值转换为活微生物数量（CFU）。

该方法的最大优势是快速（整个过程仅需5-15分钟）、操作简便，不需要培养或复杂的前处理，适用于污水排放的快速筛查（如污水处理厂出水的微生物总量检测）、工艺过程中的实时监控（如监测活性污泥中的微生物活性）。但ATP生物发光法的局限性也较明显：无法区分目标微生物与其他活细胞（如水中的藻类、原生动物），因此只能作为微生物总量的快速指标，不能用于特定微生物的检测；此外，污水中的游离ATP（如死亡细胞释放的ATP）、金属离子（如汞、铅）会抑制荧光素酶活性，导致结果偏差，需要使用ATP清除剂或抑制物去除试剂预处理样品。

流式细胞术

流式细胞术（FCM）是一种基于细胞物理化学特性的快速分析技术，原理是将污水样品中的微生物细胞用荧光染料（如SYBR Green I，结合DNA；PI，标记死细胞）染色后，通过流式细胞仪的鞘液流将细胞单个排列，依次通过激光照射区，细胞发出的散射光（反映细胞大小、形态）和荧光信号（反映细胞内DNA含量、膜完整性）被检测器捕获，进而实现对微生物细胞的计数、分类及活性分析。

在污水微生物检测中，流式细胞术常用于：①活微生物计数：用SYBR Green I（标记所有细胞）和PI（标记死细胞）双染色，区分活细胞（SYBR+PI-）和死细胞（SYBR+PI+）；②微生物群落结构分析：通过不同荧光染料标记不同类群的微生物（如革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌），分析群落组成；③污水处理工艺监控：监测活性污泥中的微生物浓度、活性变化，优化工艺参数。

流式细胞术的优势在于：快速（每分钟可分析数千个细胞）、高通量、多参数分析（同时获得细胞大小、形态、活性、DNA含量等信息），能检测到难培养的微生物，适用于污水中微生物总量、活性及群落结构的快速分析。但该方法的局限性在于：设备昂贵（流式细胞仪价格通常在几十万元以上），对操作人员的技术要求高（需掌握荧光染色、仪器调试、数据解析）；此外，污水中的悬浮物、颗粒物会干扰细胞检测，需要对样品进行预处理（如过滤、离心浓缩），去除大于微生物细胞的杂质。