药品配方检测中微生物计数的平皿培养法操作

平皿培养法是药品配方微生物计数的经典技术，通过将样品稀释液与琼脂培养基混合或涂布，培养后计数活菌菌落，直接反映药品中微生物污染程度，是《中国药典》《USP》等标准指定的核心方法。其操作规范性直接影响结果准确性，关系到药品是否符合微生物限度要求，是药企质量控制与监管核查的关键环节。本文围绕该方法的具体流程、关键控制点及特殊情况处理展开，为实验室人员提供实操指引。

样品制备与稀释

样品制备需保证均匀分散且微生物不受损伤。固体/半固体药品（如软膏、片剂）称取10g（或10ml），加入90ml无菌稀释剂（0.9%氯化钠、pH7.0磷酸盐缓冲液），用均质机（8000-10000rpm，1-2分钟）或无菌研钵研磨，制成1:10混悬液；均质时避免高速破坏微生物细胞。

液体样品（注射液、口服液）直接取10ml加90ml稀释剂，摇匀得1:10稀释液。稀释级按预计污染程度选10⁻¹至10⁻³，每级做2-3平行样；需选菌落数30-300的稀释级计数，若均超300则取最高级注明“多不可计”。

脂溶性样品（如矿物油）需用含1%聚山梨酯80的稀释剂乳化，均质2-3分钟形成乳浊液，1小时内接种避免分层。稀释时每步换无菌吸管，吸管尖端插液面下缓慢释放，防止气泡；混悬液30分钟内接种，避免微生物死亡。

要注意，稀释液体积需准确（用带刻度吸管），摇匀时避免剧烈振荡，防止微生物分布不均；若样品含颗粒，需用无菌纱布过滤（仅滤除颗粒，不截留微生物），确保稀释液均匀。

培养基选择与制备

培养基需符合标准：总需氧菌用胰酪大豆胨琼脂（TSA），霉菌/酵母菌用沙氏葡萄糖琼脂（SDA），特定菌（如大肠埃希菌）用麦康凯琼脂。TSA提供全面营养，适合革兰阳性/阴性菌生长；SDA低pH（5.6±0.2）抑制细菌，利于霉菌/酵母菌生长。

制备时按说明书称干粉，加纯化水加热搅拌至溶解；分装后121℃高压灭菌15分钟，灭菌后迅速冷却至45-50℃（倾注法用），避免成分降解。若凝固需重新熔化（不超2次），防止营养流失。

灭菌后检查pH：TSA应为7.3±0.2，SDA为5.6±0.2，用无菌pH试纸或电极测量；若偏离需用无菌盐酸/氢氧化钠调整，再灭菌。培养基需24小时内用，或4℃冷藏（不超1周），使用前确认无浑浊、杂菌。

要注意，培养基熔化后需避免污染：倾倒时瓶口靠近平皿，不接触皿边；剩余培养基需丢弃，不可重复使用；琼脂培养基若有沉淀（如Ca²+与磷酸盐反应），需过滤后再灭菌。

接种操作：倾注法与涂布法

倾注法适用于总需氧菌：取1ml稀释液加平皿（90mm），立即倒15-20ml45-50℃培养基，顺时针/逆时针各转3次，前后倾斜3次混合；避免溢出，凝固后倒置（防止冷凝水冲散菌落）。

涂布法适用于霉菌/酵母菌：先倒15-20ml培养基凝固，取0.1-0.2ml稀释液滴表面，用无菌L型玻璃棒（火焰灭菌冷却）从中心向边缘画圈涂布，确保液体覆盖；待吸收15分钟后倒置。

倾注法的关键是培养基温度：超50℃烫死微生物，低于45℃提前凝固；可将培养基放45℃恒温水浴锅保温，用温度计测温度。涂布法需注意：稀释液不超0.2ml（避免无法吸收），玻璃棒每次涂布后灭菌，防止交叉污染。

另外，平皿需预先编号（标记样品名、稀释级、日期），接种后立即盖好皿盖，避免空气微生物落入；若操作中培养基洒出，用75%乙醇擦拭消毒，更换污染的平皿。

培养条件控制

温度：TSA培养基30-35℃培养3-5天（需氧菌生长适温），SDA培养基20-25℃培养5-7天（霉菌/酵母菌生长慢）。培养箱需提前预热，温度误差≤±1℃，用温度计校准（每月1次）。

湿度：保持40-60%，避免培养基干涸。可在培养箱底部放无菌水盘，每周换一次水；若湿度低，加湿毛巾或喷雾（用无菌水）。若培养基表面干涸，菌落会停止生长，需重新培养。

倒置培养：平皿倒置可防止冷凝水从皿盖滴落到培养基，冲散菌落；培养过程中不要频繁开门（避免温度波动），若需观察，用手电筒从玻璃门外照射，避免强光直射。

培养时间：需氧菌最少培养3天（慢生长菌需5天），霉菌/酵母菌最少5天（某些霉菌需7天）；若培养3天后菌落数少，需延长至规定时间，确保所有微生物生长。

菌落计数与结果计算

培养结束后，在自然光或白色灯光下（避免强光）肉眼计数，或用菌落计数器（放大倍数10-20倍）辅助。计数时区分菌落与杂质：微生物菌落有光泽、边缘整齐、质地柔软，杂质无光泽、形态不规则、质地硬。

重叠菌落处理：两个菌落重叠≤10%，分别计数；>10%视为一个；链状菌落（如链球菌）链长>5个按1个计，<5个按实际数计。若平皿有蔓延菌落（如芽孢杆菌），需记录“蔓延生长”，不计该平皿。

结果计算：取同一稀释级平行样的平均值，乘稀释倍数。如10⁻¹稀释级平均200个，10⁻²平均25个，加权平均为（200×10 + 25×100）/2 = 2250 CFU/g。若仅一个稀释级在30-300之间，直接用该级计算；若均<30，按实际数计并注“少不可计”。

有效数字：结果保留两位，超1000用科学计数法（如2.5×10³ CFU/g）。记录需包括：样品名、稀释级、培养基、培养条件、菌落数，确保可追溯；若结果异常（如突然升高），需重新检测确认。

操作中的污染防控

环境控制：微生物室需分洁净区（万级背景+百级超净台），定期测沉降菌（每平皿≤10 CFU/30分钟）、浮游菌（≤500 CFU/m³）。超净台需提前30分钟开紫外灯（灭菌空气），操作时关紫外灯开风机，风速≥0.3m/s。

人员操作：穿无菌服、戴无菌手套/口罩，手用75%乙醇消毒（每30分钟1次）；操作时手臂不越过平皿，打开皿盖仅1/3，避免空气微生物落入；若手套接触非无菌物品，立即更换。

器材灭菌：平皿、吸管、玻璃棒需121℃灭菌15分钟，或用一次性无菌器材；稀释剂、培养基灭菌后需检查（无浑浊、沉淀），若污染立即丢弃。吸管需用无菌镊子取，避免手接触尖端。

交叉污染防控：不同样品的稀释液分开处理，吸管、玻璃棒专用；操作台定期用75%乙醇擦拭（每天1次），超净台滤网每月更换1次；若样品含高浓度微生物，操作后用含氯消毒液（500mg/L）消毒台面。

常见误差来源及应对

误差1：稀释不均匀，平行样菌落数偏差>2倍。应对：固体样品充分均质（延长均质时间至3分钟），稀释时缓慢摇匀（旋转平皿10次），用1ml刻度吸管（精度±0.01ml）取稀释液。

误差2：培养基温度不当，菌落数少或凝固不均。应对：培养基放45℃水浴锅保温，用温度计测温度（每10分钟1次）；若温度高，待冷却后再用；若凝固，重新熔化（不超2次）。

误差3：培养温度波动，菌落生长慢。应对：培养箱用温度记录仪（每小时记录1次），若波动大，检修或更换培养箱；培养过程中避免开门，若需取样品，快速操作（<1分钟）。

误差4：计数错误，结果偏高/偏低。应对：培训计数人员（熟悉常见菌落形态，如金黄色葡萄球菌菌落圆形、黄色，酵母菌菌落圆形、乳白色）；对疑似杂质，挑取涂片镜检（革兰染色，微生物有细胞结构，杂质无）。

误差5：抑菌成分干扰，结果偏低。应对：加中和剂（青霉素用青霉素酶，防腐剂用聚山梨酯80，季铵盐用卵磷脂），需验证中和剂有效性（回收率≥70%）；若中和剂无效，换薄膜过滤法（但需符合标准）。

特殊样品处理：含抑菌成分药品

抗生素、防腐剂、消毒药等含抑菌成分，会抑制微生物生长，需消除抑菌作用。常用方法：加中和剂（最常用）、稀释法（用大量稀释液降低抑菌浓度）、薄膜过滤法（但平皿法优先用中和剂）。

中和剂选择：青霉素类用青霉素酶（1000单位/ml稀释液），β-内酰胺类用β-内酰胺酶，对羟基苯甲酸酯用1%聚山梨酯80，季铵盐用0.1%卵磷脂+1%聚山梨酯80（协同中和）。

中和剂验证：取不含抑菌成分的样品，加100 CFU/ml标准菌株（如大肠埃希菌ATCC25922），再加中和剂，培养后计数；若回收率≥70%，说明有效；若<70%，调整中和剂浓度（如增加青霉素酶至2000单位/ml）或更换中和剂。

注意：中和剂不能抑制微生物生长，也不能与样品反应。比如聚山梨酯80不能与阳离子表面活性剂（如季铵盐）反应，否则失效；加入中和剂后，需测稀释液pH（保持7.0左右），避免影响微生物生长。

平皿培养法是药品配方微生物计数的经典技术，通过将样品稀释液与琼脂培养基混合或涂布，培养后计数活菌菌落，直接反映药品中微生物污染程度，是《中国药典》等标准指定的核心方法。其操作规范性直接影响结果准确性，关系到药品是否符合微生物限度要求，是药企质量控制与监管核查的关键环节。本文围绕该方法的具体流程、关键控制点及特殊情况处理展开，为实验室人员提供实操指引。

样品制备与稀释

样品制备需保证均匀分散且微生物不受损伤。固体或半固体药品（如软膏、片剂）称取10g（或10ml），加入90ml无菌稀释剂（0.9%氯化钠、pH7.0磷酸盐缓冲液），用均质机（8000-10000rpm，1-2分钟）或无菌研钵研磨，制成1:10混悬液；均质时避免高速破坏微生物细胞。

液体样品（注射液、口服液）直接取10ml加90ml稀释剂，摇匀得1:10稀释液。稀释级按预计污染程度选10⁻¹至10⁻³，每级做2-3平行样；需选菌落数30-300的稀释级计数，若均超300则取最高级注明“多不可计”。

脂溶性样品（如矿物油）需用含1%聚山梨酯80的稀释剂乳化，均质2-3分钟形成乳浊液，1小时内接种避免分层。稀释时每步换无菌吸管，吸管尖端插液面下缓慢释放，防止气泡；混悬液30分钟内接种，避免微生物死亡。

要注意，稀释液体积需准确（用带刻度吸管），摇匀时避免剧烈振荡，防止微生物分布不均；若样品含颗粒，需用无菌纱布过滤（仅滤除颗粒，不截留微生物），确保稀释液均匀。

培养基选择与制备

培养基需符合标准：总需氧菌用胰酪大豆胨琼脂（TSA），霉菌/酵母菌用沙氏葡萄糖琼脂（SDA），特定菌（如大肠埃希菌）用麦康凯琼脂。TSA提供全面营养，适合革兰阳性/阴性菌生长；SDA低pH（5.6±0.2）抑制细菌，利于霉菌/酵母菌生长。

制备时按说明书称干粉，加纯化水加热搅拌至溶解；分装后121℃高压灭菌15分钟，灭菌后迅速冷却至45-50℃（倾注法用），避免成分降解。若凝固需重新熔化（不超2次），防止营养流失。

灭菌后检查pH：TSA应为7.3±0.2，SDA为5.6±0.2，用无菌pH试纸或电极测量；若偏离需用无菌盐酸/氢氧化钠调整，再灭菌。培养基需24小时内用，或4℃冷藏（不超1周），使用前确认无浑浊、杂菌。

要注意，培养基熔化后需避免污染：倾倒时瓶口靠近平皿，不接触皿边；剩余培养基需丢弃，不可重复使用；琼脂培养基若有沉淀（如Ca²+与磷酸盐反应），需过滤后再灭菌。

接种操作：倾注法与涂布法

倾注法适用于总需氧菌：取1ml稀释液加平皿（90mm），立即倒15-20ml45-50℃培养基，顺时针/逆时针各转3次，前后倾斜3次混合；避免溢出，凝固后倒置（防止冷凝水冲散菌落）。

涂布法适用于霉菌/酵母菌：先倒15-20ml培养基凝固，取0.1-0.2ml稀释液滴表面，用无菌L型玻璃棒（火焰灭菌冷却）从中心向边缘画圈涂布，确保液体覆盖；待吸收15分钟后倒置。

倾注法的关键是培养基温度：超50℃烫死微生物，低于45℃提前凝固；可将培养基放45℃恒温水浴锅保温，用温度计测温度。涂布法需注意：稀释液不超0.2ml（避免无法吸收），玻璃棒每次涂布后灭菌，防止交叉污染。

另外，平皿需预先编号（标记样品名、稀释级、日期），接种后立即盖好皿盖，避免空气微生物落入；若操作中培养基洒出，用75%乙醇擦拭消毒，更换污染的平皿。

培养条件控制

温度：TSA培养基30-35℃培养3-5天（需氧菌生长适温），SDA培养基20-25℃培养5-7天（霉菌/酵母菌生长慢）。培养箱需提前预热，温度误差≤±1℃，用温度计校准（每月1次）。

湿度：保持40-60%，避免培养基干涸。可在培养箱底部放无菌水盘，每周换一次水；若湿度低，加湿毛巾或喷雾（用无菌水）。若培养基表面干涸，菌落会停止生长，需重新培养。

倒置培养：平皿倒置可防止冷凝水从皿盖滴落到培养基，冲散菌落；培养过程中不要频繁开门（避免温度波动），若需观察，用手电筒从玻璃门外照射，避免强光直射。

培养时间：需氧菌最少培养3天（慢生长菌需5天），霉菌/酵母菌最少5天（某些霉菌需7天）；若培养3天后菌落数少，需延长至规定时间，确保所有微生物生长。

菌落计数与结果计算

培养结束后，在自然光或白色灯光下（避免强光）肉眼计数，或用菌落计数器（放大倍数10-