无菌药品配方检测的微生物限度检查操作指南

无菌药品的安全性核心在于微生物污染控制，而配方检测中的微生物限度检查是验证药品是否符合无菌要求的关键环节。该检查通过定量计数非致病菌、定性筛查控制菌，直接反映配方在生产、存储过程中的微生物污染状态。本文结合《中国药典》（2020版）等法规要求，从操作全流程出发，梳理微生物限度检查的关键步骤与技术细节，为实验室规范操作提供实操指南。

微生物限度检查的前置条件：环境与设备验证

微生物限度检查需在符合GMP要求的洁净环境中进行，核心操作（如供试液制备、接种）应在A级洁净区（或隔离系统）内完成。A级区的悬浮粒子需满足0.5μm粒子≤3520个/m³、10μm粒子≤20个/m³，沉降菌≤1 CFU/Φ90mm培养皿（4小时）。操作前需开启超净工作台风机30分钟以上，验证风速在0.36~0.54m/s之间，确保气流形成有效屏障。

设备需定期校准与验证：培养箱需验证温度均匀性（偏差≤±1℃），每月用温度记录仪检测不同位置的温度；压力蒸汽灭菌器需每季度做生物指示剂验证（如嗜热脂肪芽孢杆菌孢子，灭菌后存活率≤0.1%）；消毒剂（如75%乙醇、0.1%新洁尔灭）需每批做微生物挑战试验，用金黄色葡萄球菌或大肠埃希菌测试杀菌率≥99.9%，确保消毒有效性。

实验前需对环境做动态监测：用浮游菌采样器收集100L空气，培养后菌落数≤1 CFU；操作人员需穿无菌服、戴无菌手套，手部消毒后用棉签擦拭采样，培养后无细菌生长，避免人为污染。

样品制备：均一性与代表性的把控

样品制备的核心是保证供试液的均一性，避免因样品不均导致结果偏差。固体样品（如片剂、散剂）需取10g，加入90mL稀释剂（优先选0.9%氯化钠溶液或pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液），用均质器以8000~10000r/min均质1~2分钟，制成1:10供试液；若样品含油脂（如软膏），需加等量聚山梨酯80乳化，再用稀释剂定容，确保油脂分散均匀。

液体样品（如注射剂、口服液）需充分摇匀，取10mL加入90mL稀释剂，制成1:10供试液；若样品pH<4或>9，需用pH调节剂（如1mol/L盐酸或氢氧化钠）调整至6~8，避免过酸/过碱抑制微生物生长。

含抗菌成分的样品需加灭活剂：如青霉素类药物加青霉素酶（1000U/mL供试液），季铵盐类防腐剂加聚山梨酯80（1%~5%），确保抗菌成分被中和。灭活效果需验证——向供试液中加入100~1000CFU试验菌，培养后菌落数与未加样品的对照液差异≤10%，说明灭活完全。

试验菌液的制备：浓度与活性的精准控制

试验菌需选用《中国药典》规定的标准菌株（如大肠埃希菌CMCC(B)44102、金黄色葡萄球菌CMCC(B)26003），从冷冻保存管中取出后，先接种至营养肉汤培养基，35℃培养18~24小时活化。活化后的菌液需梯度稀释（用0.9%氯化钠溶液），通常稀释至10⁻⁵~10⁻⁷倍，确保每mL菌液含100~1000CFU（活菌计数验证）。

菌液需现用现配，4℃保存不超过24小时；若需长期保存，可制成甘油悬液（20%甘油），-20℃保存6个月，使用前需重新活化并验证浓度。

活菌计数方法：取0.1mL稀释菌液涂布于营养琼脂平板，35℃培养24小时，计数菌落数（30~300CFU/平板有效），计算每mL菌液的活菌数。如某批次大肠埃希菌液涂布后长出50个菌落，稀释倍数为10⁻⁶，则菌液浓度为50×10/10⁻⁶=5×10⁸CFU/mL？不对，应该是0.1mL涂平板，所以是50×10（因为0.1mL是1mL的1/10）×稀释倍数的倒数，比如稀释10⁻⁶，就是50×10×10⁶=5×10⁸？不对，正确的计算是：菌落数×稀释倍数×10（因为取了0.1mL），比如0.1mL 10⁻⁶的菌液长出50个菌落，就是50×10⁶×10=5×10⁸CFU/mL？其实正确的应该是，比如菌液稀释到10⁻⁶，取1mL加到平板里，长出50个菌落，就是50×10⁶=5×10⁷CFU/mL；如果取0.1mL，就是50×10×10⁶=5×10⁸CFU/mL。需要确保菌液浓度在10⁵~10⁷CFU/mL之间，这样接种0.1mL就是10⁴~10⁶CFU？不对，应该是试验菌液的浓度是10⁵~10⁷CFU/mL？不，《中国药典》要求试验菌液的浓度是每mL含10~100CFU？不对，等一下，微生物限度检查中的试验菌液是用于阳性对照的，比如控制菌检查的阳性对照，需要加10~100CFU的菌液到供试液中。所以正确的制备方法是：活化后的菌液，稀释到每mL含10~100CFU，比如稀释到10⁻⁷倍，每mL含50CFU，这样接种1mL就是50CFU。

哦，刚才写错了，应该纠正：试验菌液的浓度需调整至每mL含10~100CFU（活菌计数），用于阳性对照或方法验证。比如活化后的大肠埃希菌液，取1mL加入9mL稀释剂，制成10⁻¹，再连续稀释至10⁻⁷，取1mL 10⁻⁷的菌液涂布平板，长出50个菌落，说明该稀释级的菌液浓度是50CFU/mL，符合要求。

接种与培养：操作规范性与条件一致性

接种方法需根据样品类型选择：液体供试液（如注射剂）用涂布法——取0.1mL供试液，均匀涂布于营养琼脂平板表面（用L形玻璃棒，涂布时转动平板，确保液滴覆盖整个表面）；固体供试液（如散剂）用倾注法——取1mL供试液加入平板，立即倒入15mL融化的营养琼脂（45~50℃，温度过高会烫死微生物，过低会凝固），轻轻转动平板混合均匀，待凝固后倒置培养。

培养条件需严格一致：细菌培养用30~35℃，真菌用20~25℃；细菌培养24~48小时（如大肠埃希菌24小时即可长出典型菌落），真菌培养5~7天（如白色念珠菌需5天）。培养箱需保持湿度≥60%，避免培养基干裂——可在箱内放置盛有灭菌水的托盘，或用带盖培养皿（避免水分蒸发）。

接种过程需避免交叉污染：每处理一个样品后，需用75%乙醇擦拭超净工作台表面；涂布用的玻璃棒需高压灭菌（121℃，20分钟），或用一次性无菌玻璃棒；培养皿需倒置培养，防止冷凝水滴落冲散菌落。

微生物计数：结果读取的准确性原则

菌落计数需在培养结束后1小时内完成，优先选择菌落数在30~300CFU/平板的稀释级（该范围的计数误差≤10%）。若所有稀释级的菌落数均超过300，需选用更高稀释级（如1:100、1:1000）重新测试；若均低于30，需记录实际菌落数（如“2 CFU/平板”）。

菌落识别需结合形态特征：细菌菌落通常小（直径1~3mm）、光滑、湿润（如大肠埃希菌为灰白色圆形菌落）；真菌菌落大（直径5~10mm）、蓬松、有菌丝（如黑曲霉为黑色绒毛状菌落）。重叠菌落需区分：若两个菌落有明显界限（如边缘不融合），计为2个；若完全融合（如链球菌的链状生长），计为1个。

平行样需做双份：取两个平板接种同一供试液，计算平均数（如平板1为45CFU，平板2为55CFU，平均数为50CFU）。若两份平板的菌落数差异超过1倍（如平板1为30，平板2为70），说明操作误差大，需重新测试。

控制菌检查：目标菌的特异性鉴别

控制菌检查需针对药品的风险设定（如口服药需查大肠埃希菌，注射剂需查铜绿假单胞菌），核心是“特异性”——仅目标菌能在选择性培养基上生长。以大肠埃希菌检查为例：取10mL供试液加入90mL麦康凯液体培养基（增菌，35℃培养18~24小时），取1环增菌液划线接种于麦康凯琼脂平板（选择性培养基，抑制革兰阳性菌生长），35℃培养24小时，观察是否有桃红色、圆形、光滑的典型菌落（大肠埃希菌分解乳糖产酸，使培养基中的中性红变红）。

生化鉴定是确认目标菌的关键：挑取典型菌落接种于三糖铁琼脂（TSI），大肠埃希菌会使斜面变黄（产酸）、底层变黄（产酸）、不产气（或微量产气）、无硫化氢（底层不变黑）；再做靛基质试验（阳性，产生吲哚，加对二甲氨基苯甲醛显红色）、甲基红试验（阳性，pH<4.4，显红色）、VP试验（阴性，不产生乙酰甲基甲醇）、枸橼酸盐试验（阴性，不能利用枸橼酸盐），四项试验符合“++--”即可确认。

阳性对照与阴性对照需同步进行：阳性对照——向稀释剂中加入10~100CFU大肠埃希菌，按上述方法操作，需能检出典型菌落；阴性对照——向稀释剂中加入0.1mL无菌水，操作后无菌落生长，确保试验方法无干扰。

异常结果处理：偏离情况的调查与纠正

若菌落数超过限度（如某注射用维生素C的菌落数为150CFU/g，限度为≤10CFU/g），或检出控制菌（如口服药检出沙门菌），需立即启动调查：首先复查样品的原始记录（如是否按规定稀释、接种量是否正确），然后验证实验试剂（如培养基是否污染——取未接种的培养基培养，观察是否有菌生长；稀释剂是否无菌——取10mL稀释剂培养，无菌生长），再检查环境与设备（如超净工作台的风速是否降至0.3m/s以下，培养箱的温度是否高达38℃）。

若调查发现是操作失误（如涂布时玻璃棒未灭菌），需重新测试同批次样品（用新的供试液、新的培养基）；若发现是样品污染（如原料带入微生物），需追溯原料的检验记录（如原料的微生物限度是否合格），并对原料供应商进行审核。

纠正措施需落地：如因超净工作台风速不达标导致污染，需更换风机滤芯，重新验证风速；如因操作人员不熟悉流程导致误差，需对其进行再培训（如涂布法的正确操作、菌落计数的标准），并考核合格后再上岗。

记录与追溯：数据完整性的保障

记录需涵盖“人、机、料、法、环”全要素：样品信息（名称、批号、规格、来源）、操作人（姓名、工号）、操作日期、环境条件（A级区的悬浮粒子数、沉降菌数、温度、湿度）、设备信息（超净工作台编号、培养箱编号、灭菌器编号）、试剂信息（培养基批号、稀释剂批号、消毒剂批号）、试验过程（供试液稀释倍数、接种量、培养时间）、结果（菌落数、控制菌结果、阳性/阴性对照结果）。

记录需实时填写，禁止事后补记——如接种时需立即记录“2023年5月15日10:30，接种供试液0.1mL至营养琼脂平板，平板编号P230515-01”；结果读取时需记录“2023年5月17日9:00，平板P230515-01菌落数45CFU”。记录需用黑色钢笔或签字笔填写，字迹清晰，修改需划改（如将“45”改为“55”，需在“45”上划横线，旁边写“55”，并签名、注明日期）。

追溯需通过“批号链”实现：如某批次样品的菌落数异常，可通过批号追溯到原料批号（如原料A的批号20230401）、操作人（张三，工号001）、超净工作台（编号CJ-003，2023年5月10日校准过）、培养基（批号20230301，有效期至2023年9月1日），从而快速定位问题原因（如原料A的微生物限度不合格）。记录需保存至药品有效期后1年，或至少5年（以较长者为准），确保后续追溯有依据。

无菌药品的安全性核心在于微生物污染控制，而配方检测中的微生物限度检查是验证药品是否符合无菌要求的关键环节。该检查通过定量计数非致病菌、定性筛查控制菌，直接反映配方在生产、存储过程中的微生物污染状态。本文结合《中国药典》（2020版）等法规要求，从操作全流程出发，梳理微生物限度检查的关键步骤与技术细节，为实验室规范操作提供实操指南。

微生物限度检查的前置条件：环境与设备验证

微生物限度检查需在符合GMP要求的洁净环境中进行，核心操作（如供试液制备、接种）应在A级洁净区（或隔离系统）内完成。A级区的悬浮粒子需满足0.5μm粒子≤3520个/m³、10μm粒子≤20个/m³，沉降菌≤1 CFU/Φ90mm培养皿（4小时）。操作前需开启超净工作台风机30分钟以上，验证风速在0.36~0.54m/s之间，确保气流形成有效屏障。

设备需定期校准与验证：培养箱需验证温度均匀性（偏差≤±1℃），每月用温度记录仪检测不同位置的温度；压力蒸汽灭菌器需每季度做生物指示剂验证（如嗜热脂肪芽孢杆菌孢子，灭菌后存活率≤0.1%）；消毒剂（如75%乙醇、0.1%新洁尔灭）需每批做微生物挑战试验，用金黄色葡萄球菌或大肠埃希菌测试杀菌率≥99.9%，确保消毒有效性。

实验前需对环境做动态监测：用浮游菌采样器收集100L空气，培养后菌落数≤1 CFU；操作人员需穿无菌服、戴无菌手套，手部消毒后用棉签擦拭采样，培养后无细菌生长，避免人为污染。

样品制备：均一性与代表性的把控

样品制备的核心是保证供试液的均一性，避免因样品不均导致结果偏差。固体样品（如片剂、散剂）需取10g，加入90mL稀释剂（优先选0.9%氯化钠溶液或pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液），用均质器以8000~10000r/min均质1~2分钟，制成1:10供试液；若样品含油脂（如软膏），需加等量聚山梨酯80乳化，再用稀释剂定容，确保油脂分散均匀。

液体样品（如注射剂、口服液）需充分摇匀，取10mL加入90mL稀释剂，制成1:10供试液；若样品pH<4或>9，需用pH调节剂（如1mol/L盐酸或氢氧化钠）调整至6~8，避免过酸/过碱抑制微生物生长。

含抗菌成分的样品需加灭活剂：如青霉素类药物加青霉素酶（1000U/mL供试液），季铵盐类防腐剂加聚