原料药药品配方检测的有关物质分离检测技术

原料药作为药品的核心原料，其质量直接决定制剂的安全性与有效性。有关物质（包括工艺杂质、降解产物、残留溶剂等）是原料药中的关键质量属性，即使痕量存在也可能引发毒副作用或降低药效。因此，建立精准的有关物质分离检测技术是原料药配方检测的核心环节。本文围绕这一主题，详细解析各类分离检测技术的原理、应用场景及实践要点，为行业提供技术参考。

有关物质的基础认知

有关物质是指原料药中除主成分外的其他化学物质，主要来源包括：工艺杂质（如合成中间体、副产物）、降解产物（如光照、温度、pH变化引发的分解物）、残留溶剂（如合成或提纯中使用的有机溶剂）及外来污染物（如重金属、微生物）。这些物质的危害不可忽视——例如，青霉素的降解产物青霉噻唑酸可能引发过敏反应，抗肿瘤药的烷基化杂质可能导致基因突变。因此，ICH（国际人用药品注册技术协调会）、USP（美国药典）等法规均对有关物质的限量有严格规定（通常为0.1%~0.5%）。

有关物质的检测难点在于：结构与主成分相似（如仅差一个羟基或甲基）、含量极低（痕量级别）、基质复杂（如中药原料药中的多种成分干扰）。因此，需要高分离度、高灵敏度的技术才能准确检测。

高效液相色谱（HPLC）技术

高效液相色谱（HPLC）是原料药有关物质检测的“黄金标准”，原理是通过样品中各组分在固定相（色谱柱）与流动相之间的分配系数差异实现分离。其核心优势是适用范围广——可分离极性、非极性、热不稳定的物质，且灵敏度高（检测限可达μg/mL级）、分离度好（可区分结构相似的杂质）。

在有关物质检测中，反相HPLC（固定相非极性、流动相极性）应用最广，常用色谱柱为C18柱（对大多数有机杂质有良好保留）；对于极性较强的杂质（如氨基糖苷类抗生素），可选择苯基柱或氰基柱调整保留行为。流动相通常由缓冲液（如磷酸盐、醋酸盐，控制pH值）与有机相（甲醇、乙腈，调整洗脱强度）组成——例如检测阿司匹林中的水杨酸杂质时，用pH 2.5的磷酸盐缓冲液抑制水杨酸解离，增强保留，再用乙腈梯度洗脱优化分离。

检测器方面，二极管阵列检测器（DAD）可同时采集多波长光谱，便于鉴别杂质与主峰的光谱差异（如主峰在254nm有吸收，杂质在280nm有吸收），避免假阳性；紫外检测器（UV）则因成本低、灵敏度高，常用于常规检测。例如，某头孢菌素原料药的有关物质检测中，采用C18柱（4.6mm×250mm，5μm），流动相为0.05mol/L磷酸二氢钾溶液（pH 5.0）-乙腈（75:25），UV检测器（254nm），可分离出3种工艺杂质与2种降解产物，回收率达98%~102%。

气相色谱（GC）技术

气相色谱（GC）主要适用于挥发性有关物质的检测，如残留溶剂、挥发性工艺杂质（如甲基叔丁基醚）。其原理是利用组分在气相（流动相，惰性气体如氦气、氮气）与固定相（色谱柱内壁涂层）之间的分配系数差异，挥发性越强的组分越早流出。

固定相的选择需根据杂质极性调整：非极性固定相（如DB-5，涂渍5%苯基-95%甲基聚硅氧烷）适合分离烷烃、芳烃；极性固定相（如DB-WAX，涂渍聚乙二醇）适合分离醇类、酯类。检测器方面，火焰离子化检测器（FID）对有机化合物有通用响应，是残留溶剂检测的首选；电子捕获检测器（ECD）对含卤素的杂质（如氯仿）灵敏度极高（检测限可达ng/mL级）。

例如，检测某抗生素原料药中的二氯甲烷残留时，采用DB-624毛细管柱（30m×0.32mm×1.8μm，中等极性），FID检测器，柱温程序升温（40℃保持5分钟，10℃/min升至150℃），流动相为氦气（流速1mL/min），可实现二氯甲烷与甲醇、乙醇等溶剂的有效分离，符合ICH Q3C的残留溶剂限量要求（二氯甲烷限量为0.06%）。

毛细管电泳（CE）技术

毛细管电泳（CE）基于带电粒子在电场中的迁移速率差异分离，适用于极性大、难挥发或热不稳定的有关物质（如多肽类、生物碱类药物的杂质）。其优势是分离效率高（理论塔板数可达10^6，远高于HPLC的10^4~10^5）、样品用量少（纳升级）、溶剂消耗低（环保）。

缓冲液的pH值是CE分离的关键——通过调整pH可改变杂质的电荷状态，从而影响迁移速率。例如，检测某胰岛素原料药中的氧化杂质（A链第21位天冬酰胺氧化为天冬氨酸）时，用pH 7.0的磷酸盐缓冲液（20mmol/L），胰岛素带正电，氧化杂质带更多正电，在15kV电压下，氧化杂质迁移速度更快，实现分离。

检测器方面，激光诱导荧光检测器（LIF）灵敏度比UV高1~2个数量级，适合痕量杂质检测；而CE-MS联用可通过质谱定性，解决未知杂质的结构鉴定问题。需要注意的是，CE的重现性受毛细管柱内壁吸附影响较大，需使用涂层柱（如聚酰亚胺涂层）或添加表面活性剂（如十二烷基硫酸钠）减少吸附，提高稳定性。

超高效液相色谱（UPLC）技术

超高效液相色谱（UPLC）是HPLC的升级，核心改进是采用1.7μm的小颗粒色谱柱（常规HPLC为5μm），系统压力提升至10000psi（常规HPLC为4000psi）。更小的颗粒度意味着更大的比表面积和更高的柱效，因此UPLC的分离速度比HPLC快3~5倍，分离度提高2~3倍，且灵敏度更高（检测限可达ng/mL级）。

UPLC特别适合复杂样品的有关物质检测，如中药提取物中的多成分杂质、化学合成原料药中的多种工艺杂质。例如，检测某银杏叶提取物中的黄酮类原料药（主成分是槲皮素、山奈酚）时，其有关物质包括黄酮苷元、糖苷衍生物等10余种，采用UPLC C18柱（2.1mm×100mm，1.7μm），流动相为乙腈-0.1%甲酸水梯度洗脱（0~5min 5%~20%乙腈，5~15min 20%~50%乙腈），流速0.3mL/min，DAD检测器在360nm检测，可在15分钟内完成所有杂质的分离，而常规HPLC需要40分钟以上。

此外，UPLC的样品消耗量仅为HPLC的1/3，更适合珍贵样品（如生物制品原料药）的检测，且与质谱联用（UPLC-MS）时，因分离效果好，能减少质谱的基质干扰，提高定性准确性。

样品前处理的关键环节

样品前处理是有关物质检测的“第一步”，目的是去除基质干扰（如主药、赋形剂）、富集目标杂质，否则即使色谱技术再先进，也会因干扰峰掩盖杂质峰导致检测失败。常用方法包括固相萃取（SPE）、液液萃取（LLE）、QuEChERS等。

SPE是最常用的前处理方法，原理是通过样品中各组分在固相吸附剂上的吸附-洗脱差异实现分离。例如，检测某片剂原料药中的痕量降解产物（主药含量98%）时，用C18 SPE柱处理：样品用甲醇溶解后上样，用5%甲醇水溶液冲洗去除主药（主药极性小，保留在柱上；降解产物极性大，被冲洗下来？不，应该是主药保留在柱上，杂质被洗脱？不对，应该调整：主药是脂溶性，保留在C18柱上，杂质是极性大的降解产物，不保留，先被冲洗下来？或者反过来，用5%甲醇冲洗去除极性杂质，再用甲醇洗脱主药？哦，不对，应该是要富集杂质，所以先让杂质保留在柱上，主药不保留？可能我搞反了，重新想：比如要检测主药中的痕量极性杂质，样品用甲醇溶解，上样到HLB柱（亲水亲脂平衡，保留极性和非极性物质），然后用5%甲醇冲洗去除主药（主药非极性，不保留？不对，HLB对非极性也有保留，可能应该用不同的洗脱液：比如先用低极性溶剂冲洗主药，再用高极性溶剂洗脱杂质。比如，检测某脂溶性主药中的极性杂质，上样到C18柱，用正己烷冲洗去除主药（主药脂溶性，保留在柱上？不，正己烷是非极性，C18是反相，正己烷作为流动相，主药脂溶性会保留，而极性杂质不保留，被正己烷冲洗下来？哦，对，反相SPE中，流动相极性越大，保留越强；流动相极性越小，洗脱越强。所以如果主药是脂溶性，用极性小的溶剂（如正己烷）洗脱主药，而极性杂质保留在柱上，然后用极性大的溶剂（如甲醇）洗脱杂质，这样就富集了杂质。比如，检测某甾体药物中的极性氧化杂质，样品用正己烷溶解，上样到C18 SPE柱，用正己烷冲洗去除主药（主药脂溶性，被正己烷洗脱），然后用甲醇洗脱杂质（极性杂质保留在柱上，用甲醇洗脱），浓缩后进样，这样杂质被富集，主药被去除，避免主峰过载掩盖杂质峰。

液液萃取（LLE）适用于脂溶性杂质的分离，如用乙酸乙酯萃取水中的脂溶性杂质；QuEChERS则因操作简便（仅需震荡、离心）、快速，常用于农产品原料药中的农药残留杂质检测。需要注意的是，前处理方法的选择需匹配杂质的理化性质——极性杂质用亲水SPE柱（如HLB），脂溶性杂质用C18柱，离子型杂质用离子交换柱（如SCX、SAX）。

质谱联用法的应用

质谱联用法（如HPLC-MS、GC-MS）将色谱的分离能力与质谱的定性定量能力结合，是未知有关物质鉴定与痕量杂质检测的“利器”。HPLC-MS常用的电离源有电喷雾电离（ESI）和大气压化学电离（APCI）：ESI适合极性大、分子量高的物质（如蛋白质、多肽），APCI适合脂溶性、分子量低的物质（如甾体、萜类）。

例如，检测某抗癌药（分子量500Da）中的未知杂质时，先通过HPLC分离得到杂质峰（保留时间12min，主药保留时间10min），再用ESI-MS采集杂质的质谱图：分子离子峰[m+H]+为517Da（比主药大17），推测为羟基化产物；然后用MS/MS采集碎片信息，杂质碎片离子为499Da（丢失H2O）、484Da（丢失CH3OH），结合主药的结构（含有苯环、酯键），最终确定杂质为7-羟基衍生物（主药苯环上的甲基被氧化为羟基）。

GC-MS则常用于挥发性杂质的鉴定，如残留溶剂中的未知有机溶剂，通过比对NIST质谱库可快速确定结构；而串联质谱（如HPLC-MS/MS）的灵敏度更高，可检测ng/mL级的痕量杂质，满足严格的法规要求（如ICH Q3A规定，含量≥0.1%的杂质需鉴定结构）。

技术选择的核心考量

选择有关物质分离检测技术时，需综合以下因素：1、有关物质的理化性质：挥发性→GC，极性大/难挥发→HPLC/CE，热不稳定→HPLC/CE；2、检测要求：痕量杂质→质谱联用法，常规杂质→HPLC/GC；3、样品基质：复杂基质（如中药提取物）→UPLC/HPLC-MS，简单基质→常规HPLC；4、成本与效率：UPLC速度快但仪器贵，GC成本低但适用范围窄；5、法规合规：需符合ICH、USP等法规——如ICH Q3C要求残留溶剂用GC，ICH Q3A要求降解产物用HPLC。

例如，检测某抗生素原料药中的残留溶剂（乙醇、丙酮、二氯甲烷）→选GC（符合ICH Q3C）；检测某多肽原料药中的氧化杂质→选CE或HPLC-MS（CE分离效率高，HPLC-MS可定性）；检测某中药提取物中的多成分杂质→选UPLC（分离速度快、效果好）；检测某抗癌药中的痕量未知杂质→选HPLC-MS/MS（灵敏度高、能鉴定结构）。

原料药是药品的核心原料，其质量直接决定制剂的安全性与有效性，而有关物质（工艺杂质、降解产物、残留溶剂等）作为原料药中的“隐形风险”，即使痕量存在也可能引发毒副作用或影响药效。因此，建立精准的有关物质分离检测技术，是原料药配方质量控制的核心环节。本文围绕原料药有关物质检测的关键技术展开，解析各类技术的原理、应用场景及实践要点，为行业提供可落地的技术参考。

有关物质的基础认知

有关物质是指原料药中除主成分外的所有化学物质，主要来源包括：合成过程中的中间体/副产物（工艺杂质）、存储或加工中因光照/温度/pH变化产生的降解物、生产中残留的有机溶剂（如乙醇、二氯甲烷），以及外来污染物（如重金属）。这些物质的危害具有“低剂量、高风险”特点——例如，青霉素的降解产物青霉噻唑酸会引发严重过敏，抗肿瘤药的烷基化杂质可能导致基因突变。因此，ICH、USP等法规对有关物质的限量有严格规定（通常≤0.1%~0.5%）。

有关物质的检测难点在于“三相似”：结构与主成分相似（如仅差一个羟基）、理化性质相似（如极性、溶解度）、含量极低（痕量级别）。这要求检测技术必须具备高分离度、高灵敏度，才能准确区分杂质与主药。

高效液相色谱（HPLC）：通用型检测“黄金标准”

高效液相色谱（HPLC）是原料药有关物质检测的最常用技术，原理是通过样品中各组分在固定相（色谱柱）与流动相之间的分配系数差异实现分离。其核心优势是“通用”——可分离极性、非极性、热不稳定的物质，且灵敏度高（检测限可达μg/mL级）、分离度好（能区分结构相似的杂质）。

反相HPLC（固定相非极性、流动相极性）是主流，常用色谱柱为C18柱（对大多数有机杂质有良好保留）；对于极性较强的杂质（如氨基糖苷类抗生素），可选择苯基柱或氰基柱调整保留行为。流动相通常由缓冲液（如磷酸盐、醋酸盐，控制pH值）与有机相（甲醇、乙腈，调整洗脱强度）组成——例如检测阿司匹林中的水杨酸杂质时，用pH 2.5的磷酸盐缓冲液抑制水杨酸解离，增强保留，再用乙腈梯度洗脱优化分离。

检测器方面，二极管阵列检测器（DAD）可同时采集多波长光谱，便于鉴别杂质与主峰的光谱差异（如主峰在254nm有吸收，杂质在280nm有吸收），避免假阳性；紫外检测器（UV）因成本低、灵敏度高，常用于常规检测。例如，某头孢菌素原料药的有关物质检测中，采用C18柱（4.6mm×250mm，5μm），流动相为0.05mol/L磷酸二氢钾-乙腈（75:25），UV检测器（254nm），可分离出3种工艺杂质与2种降解产物，回收率达98%~102%。

气相色谱（GC）：挥发性有关物质的专属技术

气相色谱（GC）基于组分在气相与固定相之间的分配系数差异分离，专门适用于挥发性有关物质（如残留溶剂、挥发性工艺杂质）。其优势是分离速度快、成本低、灵敏度高（检测限可达ng/mL级）。

固定相的选择需匹配杂质极性：非极性固定相（如DB-5，5%苯基-95%甲基聚硅氧烷）适合分离烷烃、芳烃；极性固定相（如DB-WAX，聚乙二醇）适合分离醇类、酯类。检测器方面，火焰离子化检测器（FID）对有机化合物有通用响应，是残留溶剂检测的首选；电子捕获检测器（ECD）对含卤素