食品检验检测中心对食品中微生物指标的规范检测流程

食品中微生物指标是衡量食品安全的核心维度之一，直接关系到消费者健康。食品检验检测中心作为专业机构，其规范的微生物检测流程是确保结果准确、可靠的关键——从样品的合规接收，到仪器的精准校准，再到接种、培养、指标测定的每一步，都需严格遵循GB 4789系列标准与操作规范。本文将详细拆解检验中心针对食品微生物指标的全流程操作，还原专业检测的“每一步严谨”。

样品的接收与预处理

食品检验检测中心接收微生物检测样品时，首先需进行“三重检查”：一是核对样品标识是否清晰（包括食品名称、生产批号、采样日期、委托单位等信息），确保与委托单一致；二是检查样品状态——需冷藏的样品（如乳制品、肉制品）是否保持4℃以下，冷冻样品是否未解冻，包装是否有破损、泄漏；三是确认采样过程合规（如采样容器是否无菌、采样量是否符合GB 4789.1要求的500g/份）。不符合要求的样品需及时联系委托方，必要时拒绝接收。

接收合格的样品需立即录入实验室信息管理系统（LIMS），标注“微生物检测”类别，记录样品名称、批号、采样时间、委托方联系人等12项核心信息。预处理环节需在超净工作台内完成：固体样品（如糕点、鸡肉）称取25g，放入无菌均质袋，加入225ml无菌生理盐水（或磷酸盐缓冲液），用拍击式均质器以1000r/min均质1-2min，制成1:10的样品匀液；液体样品（如果汁、酱油）摇匀后，吸取10ml注入90ml无菌稀释液，制成1:10稀释液，如需更高稀释度（如10^-2、10^-3），需用无菌移液器逐步稀释，每步更换吸头。

预处理的关键是“无菌”：均质袋需为一次性无菌产品，均质器每次使用后用75%酒精擦拭机身；稀释液需现用现配，避免长时间放置滋生杂菌；样品匀液需在制备后1h内接种，若无法及时操作，需密封后冷藏（4℃）保存，但不得超过24h——超过时限的样品需重新采样。

仪器设备的校准与维护

微生物检测的准确性依赖仪器设备的稳定性能，检验中心需对关键设备建立“校准-维护”双轨制。高压蒸汽灭菌锅是培养基和器材灭菌的核心设备，需每季度用标准压力-温度仪校准——将仪器放入灭菌锅，运行121℃、15min程序，若实测温度偏差超过±1℃，需调整安全阀或更换密封胶圈；培养箱需每月用经CNAS认证的温度计校准，将温度计置于培养箱中层，连续记录3天温度，若日均偏差超过±0.5℃，需联系厂家调试。

移液器是接种时精准移液的关键，需每半年校准一次：用蒸馏水（20℃）作为校准介质，吸取1ml水注入天平，称量质量（1ml水应为1.000g），若误差超过±2%（如0.97g或1.03g），需调整移液器的弹簧或活塞；超净工作台的高效过滤器需每6个月检测一次，用风速仪测量工作台面风速（应为0.36-0.54m/s），若风速低于0.36m/s，需更换高效过滤器。

设备的日常维护需“定点定人”：高压蒸汽灭菌锅每次使用后，需排尽锅内余水，用干布擦干内壁，避免水垢堆积；培养箱每周清洁一次，用75%酒精擦拭内壁和隔板，去除冷凝水；移液器使用后，需将吸头杆擦干，套上保护套，避免灰尘进入；超净工作台每天操作前，用75%酒精擦拭台面和玻璃，开启紫外消毒30min。所有设备需建立“运维档案”，记录校准日期、维护内容、故障情况，确保设备状态可追溯。

培养基与试剂的制备与质量验证

培养基是微生物生长的“土壤”，需严格遵循GB 4789系列标准选择：测菌落总数用平板计数琼脂（PCA），测大肠菌群用乳糖胆盐发酵培养基（LST），测沙门氏菌用SS琼脂。制备时，先按说明书比例称量干粉（如PCA需23g/1000ml），加入蒸馏水后搅拌至完全溶解，加热至沸腾（避免糊底），用1mol/L NaOH或HCl调整pH值（PCA需7.0±0.2），然后分装到三角瓶（每瓶500ml）或试管（每管9ml LST）。

培养基灭菌需严格控制参数：三角瓶中的培养基用高压蒸汽灭菌锅121℃、15min灭菌，试管中的LST需115℃、20min灭菌（避免高温破坏乳糖成分）。灭菌后，培养基需冷却至45-50℃（用手背触摸三角瓶壁不烫），立即倒平板（每个平板倒15-20ml）或分装试管——倒平板时需避免产生气泡，若有气泡需用接种环挑破。

培养基质量需通过“双验证”：无菌验证——取3个平板或试管，置于培养箱培养24h，无菌落生长即为合格；性能验证——用标准菌株接种（如PCA接种大肠杆菌ATCC 25922，培养后形成乳白色、直径2-3mm的菌落，计数结果需在10^5-10^6 CFU/ml范围内）。试剂制备同样严格：革兰氏染色液需按GB/T 603配制，结晶紫液需用95%乙醇溶解，碘液需加入碘化钾促进溶解；生化试剂（如三糖铁琼脂）需标定还原糖含量，确保鉴定结果准确。

接种与培养的标准化操作

接种前需完成“三准备”：开启超净工作台紫外消毒30min，随后开风机运行10min；实验人员换无菌实验服、戴无菌手套，用75%酒精消毒双手；将灭菌的培养皿、移液器、吸头摆放在工作台内，避免交叉污染。

不同指标的接种方法需匹配标准：菌落总数用“平板涂布法”——用移液器吸取0.1ml样品匀液（如10^-1、10^-2、10^-3稀释度），滴加到PCA平板中央，用无菌涂布棒以顺时针方向均匀涂布（涂布棒需灼烧灭菌，冷却后使用），每个稀释度做2个平行；大肠菌群用“MPN法”——吸取1ml样品匀液接种到LST试管，做10^0、10^-1、10^-2三个稀释度，每个稀释度3管，共9管；金黄色葡萄球菌用“倾注法”——将1ml样品匀液注入平板，再倒入熔化的Baird-Parker琼脂（45℃），快速摇匀，冷却后培养。

培养条件需“精准到刻度”：菌落总数置于36±1℃培养箱培养48±2h，大肠菌群MPN法在36±1℃培养24±2h（观察产酸产气），沙门氏菌增菌需37℃培养18-24h，金黄色葡萄球菌需37℃培养24-48h。培养箱需“闭箱管理”——接种后立即关闭箱门，避免温度波动；每天定时记录温度，若出现异常（如停电），需将样品转移至备用培养箱，重新计算培养时间。

微生物指标的具体测定方法

菌落总数：培养结束后，选择菌落数在30-300CFU的平板计数（若所有平板超过300，选稀释度最高的；若低于30，选稀释度最低的）。计数时需记录“三个特征”：菌落颜色（PCA上为乳白色）、形状（圆形）、大小（直径2-3mm），计算两个平行平板的平均值，再乘以稀释倍数。例如10^-2稀释度平板计数为120和130，平均值125×100=12500 CFU/g。

大肠菌群：MPN法需先观察LST试管的“产酸产气”——培养基变黄（产酸）、杜氏小管有气泡（产气）即为阳性管。阳性管需转接至伊红美蓝琼脂（EMB）平板，培养后挑取典型菌落（紫黑色带金属光泽），接种到乳糖发酵管做证实试验。最终根据阳性管数查MPN表（如3个稀释度阳性管数为3、2、1，MPN值为110 CFU/100g）。平板计数法则是在EMB平板上计数典型菌落，乘以稀释倍数，结果以CFU/g表示。

致病菌（以沙门氏菌为例）：需经“四步鉴定”：①前增菌：样品匀液接种到缓冲蛋白胨水（BPW），36℃培养4h（恢复微生物活性）；②增菌：转接至四硫磺酸钠煌绿培养基（TTB），36℃培养18-24h（富集沙门氏菌）；③分离：取增菌液接种到SS琼脂，37℃培养24h，挑取无色透明、中心黑色的典型菌落；④鉴定：将菌落接种到三糖铁琼脂（TSI），沙门氏菌通常斜面变红（产碱）、底层变黄（产酸），产硫化氢则底层变黑；再做血清学鉴定——用沙门氏菌O抗原血清做凝集试验，若出现肉眼可见的凝集块，即为阳性。

检测过程中的无菌控制与污染预防

污染是微生物检测的“致命伤”，检验中心需建立“三级防控”体系：一级防控是“人员管理”——实验人员不得在实验室进食、喝水、说话（避免飞沫污染），操作时戴无菌手套，手套破损需立即更换；二级防控是“操作防控”——超净工作台内不得放置非无菌物品（如手机、笔记本），接种环需灼烧灭菌（插入酒精灯火焰至红热，冷却10秒后使用），移液器吸头需“一次性使用”，不得重复吸取；三级防控是“环境防控”——实验室地面每天用含氯消毒液（500mg/L）擦拭，墙面每月用酒精喷洒消毒，空调滤网每季度更换。

污染溯源需“快速定位”：若空白平板（未接种的培养基）出现菌落，需排查三个环节：培养基灭菌是否彻底（看无菌验证结果）、超净工作台是否污染（看浮游菌检测结果）、操作是否违规（看监控录像）；若样品平板出现非典型菌落，需对比空白平板——若空白平板无菌落，说明样品本身带菌；若空白平板有菌落，说明操作污染。

预防污染的关键是“常态化培训”：检验中心每月组织一次无菌操作培训，通过“实操考核”验证效果——让新员工接种空白平板，若培养后无菌落，即为合格；老员工每季度复训，重点考核“接种环灼烧”“移液器使用”等关键动作，确保操作规范。

结果的记录与复核

记录是检测结果的“溯源凭证”，需遵循“及时、准确、可追溯”原则。检验员需在操作过程中实时记录：样品预处理时记录均质时间、稀释倍数；接种时记录移液器型号、吸液量；培养时记录培养箱编号、温度；计数时记录平板菌落数、典型特征。记录需用黑色签字笔填写，不得涂改——若需修改，需在修改处画横线，注明修改人、日期和原因（如“120→130，因计数时漏看1个菌落，张三，2024.05.10”）。

结果复核需“双人双审”：第一审是“数据审”——复核员核对稀释倍数计算是否正确（如10^-2稀释度×100）、计数平板选择是否符合30-300CFU要求；第二审是“逻辑审”——复核员检查典型菌落特征是否匹配（如沙门氏菌在TSI上的反应是否符合）、生化鉴定结果是否一致（如三糖铁琼脂和血清学鉴定是否都阳性）。若复核发现问题（如计数结果偏差超过10%），需立即要求检验员重新检测，并记录问题原因。

记录完成后，需录入LIMS系统，生成“检测报告”——报告需包含样品信息、检测方法、仪器设备、结果判定、检验员和复核员签字。报告需在检测完成后3个工作日内出具，委托方若有异议，需在收到报告后15日内提出，检验中心需提供原始记录和溯源证据，重新检测并出具补充报告。