化妆品毒理测试中急性经口毒性试验的检测流程

急性经口毒性试验是化妆品毒理安全评价的核心基础试验，旨在评估人体意外摄入化妆品（如儿童误食、成人误用）后可能产生的急性健康风险。该试验通过向动物单次灌胃受试物，观察14天内的中毒症状、死亡情况及生理变化，确定半数致死剂量（LD50），为化妆品安全性分类与标签警示提供科学依据。作为化妆品注册备案的必做项目，其流程需严格遵循《化妆品安全技术规范》（2015版）及OECD 401等标准，确保结果可靠可比。

试验前的方案设计与受试物处理

试验第一步是制定详细方案，需明确受试物信息（名称、批号、有效成分）、依据标准、动物种类与数量及检测指标，方案需经伦理审查符合动物福利要求。

受试物处理需先测定物理性质：固体需研磨成细粉，液体需确认pH值（避免强酸碱损伤胃肠道）。难溶物需选无毒性助溶剂（如0.5%-1%羧甲基纤维素钠、花生油），助溶剂需提前验证安全性。受试物浓度按“每千克体重给予的成品质量（mg/kg bw）”计算，复方化妆品以成品总质量为基准。

试验器材需提前校准：灌胃针选合适规格（大鼠16-18号、小鼠20-22号），确保尖端光滑；电子天平精确至0.1g，用于称量受试物与动物体重；注射器需高压灭菌，避免交叉污染。所有器材需提前检查功能性，如灌胃针是否通畅、注射器是否漏液。

试验动物的选择与饲养条件

首选SPF级大鼠或小鼠，因繁殖快、成本低、生理数据全，且对化学物质反应与人类相关性好。要求雌雄各半，覆盖不同性别毒性差异——即使化妆品针对女性，男性也可能误食，雌雄同试更符合实际风险。

动物年龄与体重需严格控制：大鼠6-8周龄（180-220g）、小鼠18-22g（4-6周龄），均为成年动物（幼龄动物代谢弱，毒性反应敏感，不符合“模拟成人摄入”目的）。试验前检疫3-5天，观察外观（毛发光滑无外伤）、行为（活跃无共济失调）及饮食情况，剔除患病个体。

饲养环境需符合GB 14925标准：温度20-26℃、湿度40-70%，12小时明暗循环光照；饲料为无激素无抗生素全价颗粒料，饮水为无菌蒸馏水。笼具每周更换2-3次，保持清洁干燥，避免动物应激干扰结果。

剂量组的预试验与正式设计

剂量设计需先做预试验：普通化妆品（如面霜）预期毒性低，先做“限量试验”（5000mg/kg bw），14天无死亡则判定“实际无毒”；若出现死亡，需做“梯度预试验”（如100、300、1000mg/kg bw），缩小致死剂量范围。

正式试验设3-5个剂量组（含对照组），剂量间距用几何级数（1:2或1:3），确保准确计算LD50。例如预试验发现致死剂量在300-1000mg/kg bw，正式组可设300、600、1200mg/kg bw（间距1:2）。对照组给予等量溶剂（如助溶剂为羧甲基纤维素钠，则对照组给等量该溶液），排除溶剂干扰。

剂量计算需精确：液体先测密度（比重瓶法）换算体积；固体称准质量，用助溶剂溶解定容。例如某化妆品密度1.2g/ml，需给200g大鼠1000mg/kg bw剂量，体积为（1000mg/kg×0.2kg）÷（1.2g/ml×1000mg/g）=0.17ml。

灌胃染毒的操作规范

染毒前禁食：大鼠禁食16小时（过夜不禁水）、小鼠禁食12小时，减少胃肠道内容物对受试物吸收的影响——胃内有食物会延缓吸收，导致毒性反应延迟或减弱。禁食时间需严格，过长导致体重下降，过短影响吸收。

灌胃操作需熟练：抓大鼠时用左手拇指食指抓双耳及颈部皮肤，其余手指固定背部，使头部略仰（避免插入气管）；右手持灌胃针从口角插入，沿咽后壁推进3-5cm（大鼠），感到“落空感”即进入胃内。灌胃体积遵循“大鼠每100g体重≤1ml，小鼠每10g≤0.1ml”，避免胃扩张破裂。

灌后观察：若动物咳嗽、呼吸困难，说明插入气管需重新操作；若呕吐需记录时间次数（呕吐会减少吸收影响结果）。染毒后将动物放回笼中，标记编号、剂量组及时间，便于后续观察。

中毒症状与生存状况的观察记录

染后观察需及时全面：0-4小时每15分钟观察一次，关注震颤、抽搐、流涎、腹泻、共济失调等急性症状（提示神经、消化或呼吸系统受损）；24-72小时每天观察2-3次，记录活动、饮食及体重；7天后每天一次至第14天。

死亡动物需及时记录时间，立即大体解剖观察内脏病变（如胃出血、肝肿大）；存活动物每周称量体重2次，绘制体重增长曲线——高剂量组体重持续下降，说明影响消化代谢。

需详细记录每只动物的症状：如某大鼠染毒后30分钟出现流涎，2小时后共济失调，48小时死亡，需标注时间点与症状类型，便于分析剂量-反应关系。

毒性指标的检测与分析

所有动物（死亡与存活）试验结束后需大体解剖：用镊子分离皮肤肌肉，观察胃黏膜（有无充血溃疡）、肝（颜色是否异常）、肾（有无浑浊）等器官的肉眼病变，记录部位与程度。

有病变的器官需做组织病理学检查：取病变组织（如胃黏膜、肝小叶）用10%福尔马林固定，石蜡包埋切片（4-5μm），HE染色后镜下观察细胞变化（如肝细胞坏死、肾小管变性），精准判断毒性靶器官（如肝脂肪变性提示靶器官是肝）。

计算食物利用率：每周记录每只动物的食物摄入量与体重增加量，比值=（体重增加量/食物摄入量）×100%。高剂量组食物利用率显著低于对照组（如对照组30%、高剂量组15%），说明受试物抑制消化或导致拒食。

LD50计算与毒性分级

试验结束用概率单位法或Bliss法计算LD50及95%置信区间。例如某化妆品LD50为2500mg/kg bw，置信区间1800-3200mg/kg bw，根据《急性毒性试验》（GB 15193.3-2014）分级为“低毒”。

毒性分级标准：LD50>5000mg/kg bw为“实际无毒”，2000-5000mg/kg为“低毒”，1000-2000mg/kg为“中等毒”，50-300mg/kg为“高毒”，5-50mg/kg为“剧毒”，≤5mg/kg为“极毒”。

需注意，LD50仅反映单次摄入的急性毒性，不代表长期接触的安全性，但作为安全评价第一步，其结果是判断化妆品“初步安全”的关键——若LD50≤5mg/kg bw，直接判定不合格，无需后续试验。