原料药杂质分析中定量限和检测限的确定方法及验证流程是什么

原料药中的杂质直接影响药品安全性与有效性，杂质分析是质量控制核心环节。定量限（LOQ）与检测限（LOD）作为杂质分析方法的关键性能指标，分别定义“能准确定量的最低杂质浓度”与“能可靠检测到的最低杂质浓度”，其确定方法与验证流程直接决定结果可信度。本文结合ICH、USP等指导原则，梳理LOD/LOQ的确定方法及验证要点，为原料药杂质分析提供实操参考。

LOD与LOQ的基本概念区分

在杂质分析中，LOD与LOQ常被混淆，但定义与用途差异显著。LOD是“规定条件下能检测到杂质存在的最低浓度”，强调“存在性”；LOQ是“规定条件下能以可接受准确性、精密度定量的最低浓度”，强调“定量性”。例如，某杂质LOD为0.1μg/mL，意味着≥0.1μg/mL时能“发现”它；LOQ为0.3μg/mL，则≥0.3μg/mL时才能“准确计算”含量。

两者逻辑关联清晰：LOQ必然高于LOD——若无法“检测到”，更无法“定量”。ICH Q2(R1)要求，LOD/LOQ需与方法线性、准确性联动，避免孤立计算。实际工作中需明确方法用途：筛查痕量杂质（如基因毒性杂质）看LOD，定量控制（如降解产物）看LOQ。

基于信噪比法的LOD/LOQ确定

信噪比（S/N）法是最常用的LOD/LOQ确定方法，适用于色谱、光谱等依赖信号强度的技术，核心逻辑是“信号峰高与基线噪声的比值”——S/N≈3:1为LOD，S/N≈10:1为LOQ。

具体操作：先制备空白溶剂（如流动相），进样记录基线噪声（取杂质保留时间前后1-2分钟稳定基线，计算标准偏差或峰-峰噪声）；再制备梯度浓度杂质标准溶液（从低浓度开始逐步提高），依次进样记录峰高；最后计算各浓度S/N值，找到对应比值的浓度即为LOD/LOQ。

需注意排除“伪噪声”：若空白溶剂在杂质保留时间有杂峰，需优化色谱条件（如调整流动相）。若基线波动大，可连续进3次空白取平均噪声，降低误差。这种方法直观易操作，但依赖分析人员对“信号与噪声”的判断。

校准曲线法的应用

校准曲线法基于线性回归，通过“截距标准偏差（σ）”与“曲线斜率（S）”推导LOD/LOQ，公式为LOD=3.3σ/S、LOQ=10σ/S（ICH Q2(R1)规定），适用于线性良好的方法。

操作步骤：选5-7个浓度点的杂质标准溶液（覆盖LOQ到线性上限），每个浓度进样2-3次；以浓度为横坐标、信号为纵坐标，用最小二乘法拟合线性方程（y=Sx+b）；计算截距b的标准偏差σ（用Excel或Origin统计）；代入公式得LOD/LOQ。例如，方程y=1200x+50，σ=10、S=1200，则LOD≈0.0275μg/mL、LOQ≈0.083μg/mL。

关键是确保线性良好：相关系数r≥0.995（ICH要求），否则σ与S计算误差大。浓度点需覆盖LOQ附近——若最低浓度远高于LOQ，会导致σ不准确。比如LOQ约0.1μg/mL，校准曲线最低浓度应设为0.05μg/mL（接近LOD），最高设为1μg/mL（线性上限）。

标准加入法的补充

当原料药基质（如API、辅料、降解产物）产生干扰（抑制或增强信号）时，信噪比法与校准曲线法可能偏差，需用标准加入法消除基质效应。

操作逻辑：向空白原料药基质（不含目标杂质）中加梯度浓度杂质标准品，制备“基质加标样品”，计算“基质中的LOD/LOQ”。具体步骤：取空白原料药按样品方法提取（超声、过滤）得空白基质溶液；向其中加梯度浓度杂质标准品，制备加标样品；进样测信号，用信噪比或校准曲线法计算LOD/LOQ。

例如，某原料药空白基质在杂质保留时间有弱干扰，纯标准品LOD为0.1μg/mL，基质加标后LOD为0.15μg/mL——这更贴近实际样品情况。需注意空白基质需“真实”：若原料药会降解，应选未降解的新鲜API，确保加标杂质仅来自人工加入。

验证流程中的方法适用性确认

LOD/LOQ确定前需先验证方法“适用性”——即能准确检测与定量杂质，内容包括线性、准确性、精密度。

线性验证：制备5-7个浓度点标准溶液，r≥0.995；准确性验证：在LOQ、100%限度、150%限度浓度加标回收，回收率80%-120%；精密度验证：LOQ浓度重复6次，RSD≤10%。只有这些指标符合要求，LOD/LOQ结果才可靠。例如，若线性r=0.98（<0.995），需优化方法（调整检测波长）再计算LOD/LOQ。

重复性与中间精密度验证

重复性是“同一人、同一设备、相同条件下，对LOQ浓度样品多次测定的一致性”；中间精密度是“不同人、不同设备、不同时间的一致性”，均为核心指标。

重复性要求：取LOQ浓度样品连续进样6次，RSD≤10%。例如，LOQ=0.1μg/mL，6次结果0.095、0.102、0.098、0.105、0.097、0.101μg/mL，平均值0.100μg/mL，RSD≈3.2%，符合要求。

中间精密度要求：另一人用另一台色谱仪，间隔1周重复试验，两次RSD≤15%。例如，第一次RSD=3.2%，第二次=4.1%，整体RSD≈3.7%，符合要求。需注意验证需覆盖LOQ浓度，仅验证中间浓度无法证明LOQ处可靠性。

耐用性验证的实施

耐用性是“分析条件微小变化时，LOD/LOQ的变化程度”，变化包括流动相比例±5%、pH±0.2、柱温±5℃、流速±10%等，目的是确保方法对操作波动稳定。

操作步骤：先确定基准条件（如乙腈-水=60:40、pH=6.8、柱温30℃）；逐一改变条件，重新计算LOD/LOQ；比较变化条件与基准条件的相对偏差（RD），需≤20%。例如，流动相比例变55:45，LOQ从0.1μg/mL变为0.11μg/mL，RD=10%，符合要求；柱温变35℃，LOQ=0.095μg/mL，RD=-5%，符合要求。

若某条件变化导致RD超20%，需优化——比如流动相pH变0.2导致LOQ变0.15μg/mL（RD=50%），需缩窄pH控制范围（6.8±0.1）或换缓冲盐（磷酸盐代替醋酸盐），提高耐用性。