原料药杂质分析中不确定度评估的主要步骤和计算方法是什么

原料药杂质分析是保证药品安全有效的关键环节，而不确定度评估则是衡量分析结果可靠性的核心工具——它能量化结果的分散性，为杂质限度判断、方法验证提供科学依据。本文结合ICH Q2（R1）、USP <41>等指导原则，系统梳理原料药杂质分析中不确定度评估的主要步骤，并拆解关键计算方法，助力分析人员建立规范的评估流程。

确定评估目标与数学模型

不确定度评估的起点是明确“评估对象”——在原料药杂质分析中，评估目标通常是“特定杂质的含量结果”，如“杂质A的质量分数w（%）”或“未知杂质的浓度c（μg/g）”。需注意：评估目标需与分析方法的“报告结果”一致（如方法验证中报告的是“平均含量”，则评估对象为平均结果；若为“单次测定结果”，则评估对象为单次值）。

下一步是建立“数学模型”——将评估目标与直接测量的输入量关联，模型需全面覆盖所有影响结果的步骤。例如，外标法测定杂质含量时，样品需经过称量、溶解、定容、稀释，对照品需配制浓度，最终通过峰面积计算，因此数学模型为：w = (A样×C标×V×D)/(A标×m×1000)。其中：A样是样品溶液中杂质的峰面积，C标是对照品溶液的浓度（μg/mL），V是样品定容体积（mL），D是样品的稀释倍数，A标是对照品溶液的峰面积，m是样品的称样量（g），1000是单位转换因子（将μg转换为g）。

数学模型的准确性需验证：若模型遗漏关键输入量（如稀释步骤的误差），会导致不确定度低估。例如，若样品需稀释2倍（D=2），但模型中未包含D，则稀释体积的误差（如移液管的体积误差）无法计入，最终结果的不确定度会偏小。因此，建立模型时需“跟着方法走”——每一步操作对应一个输入量。

此外，数学模型的形式需便于计算：乘法/除法模型（如外标法、面积归一化法）更适合用“相对标准不确定度”计算，加法/减法模型（如差值法测定杂质）则需用“绝对标准不确定度”计算。例如，差值法w = 总杂质-已知杂质，模型为加法，合成不确定度是各杂质不确定度的方和根。

识别不确定度来源

识别来源是不确定度评估的“全面性保障”——需覆盖从样品制备到结果计算的全流程，常见方法是“因果图法”（鱼骨图），将来源分为“人、机、料、法、环”五大类：

1、人员操作：样品称量的重复性（如称样时的手抖导致的质量差异）、定容时的视线误差（如凹液面未与刻度线对齐）、峰面积积分的主观性（如积分参数调整）；

2、仪器设备：天平的校准误差（如天平显示值与实际质量的差异）、液相色谱仪的输液泵准确性（影响流动相流速，进而影响峰面积）、检测器的线性范围（峰面积与浓度的线性关系误差）；

3、试剂与对照品：对照品的纯度不确定度（如证书上的纯度±0.5%）、溶剂的纯度（如溶剂中的杂质干扰样品峰）、对照品溶液的稳定性（如光照导致的降解）；

4、方法本身：方法的回收率（如样品前处理导致的杂质损失）、方法的重复性（同一分析员同一仪器的短期变异）、方法的中间精密度（不同分析员不同仪器的长期变异）；

5、环境因素：实验室温度的变化（影响溶液体积——温度每变化1℃，水的体积变化约0.02%）、湿度的变化（影响样品的吸湿性，导致称样量误差）。

以面积归一化法为例，具体来源包括：峰面积积分的准确性（积分参数设置）、峰分离度（相邻峰的干扰）、仪器的稳定性（保留时间漂移导致的峰匹配错误）、样品的均匀性（原料药混合不均导致的样品代表性误差）。需注意：若某来源的影响可通过方法验证消除（如通过过滤去除溶剂杂质），则无需计入；若无法消除（如积分的主观性），则必须量化。

量化各输入量的标准不确定度

标准不确定度是单个输入量的不确定度，分为A类（统计法）和B类（非统计法），两者的区别在于“数据来源”：A类用试验数据，B类用已有信息。

A类评估：适用于可重复测量的输入量，如样品峰面积的重复性、称样量的重复性。计算方法是“样本标准差除以根号n”（n为测量次数）。例如，对杂质A进行6次平行称量，称样量分别为1.002g、1.001g、1.003g、1.002g、1.001g、1.002g，平均值m̄=1.002g，样本标准差s=√[(0+0.000001+0.000001+0+0.000001+0)/(6-1)]=√0.0000006≈0.000775g，则标准不确定度u(m)=s/√n=0.000775/√6≈0.000317g（即0.317mg）。

B类评估：适用于无法重复测量的输入量，如天平的校准误差、对照品的纯度不确定度。计算方法是“最大允许误差除以包含因子”（包含因子k根据分布类型选择）。常见分布类型及k值：（1）均匀分布（矩形分布）：输入量在[a,b]范围内均匀分布，k=√3（如天平的最大允许误差、移液管的体积误差）；（2）正态分布：输入量服从正态分布，k=1.96（对应95%置信水平，如对照品的纯度证书）；（3）三角分布：输入量在[a,b]范围内，中间值出现概率最高，k=√6（如人员定容的视线误差）。

例如，移液管的校准证书显示体积为10.00mL，最大允许误差±0.02mL（均匀分布），则体积的标准不确定度u(V)=0.02/√3≈0.0115mL；对照品的纯度证书显示纯度为99.0%±0.5%（正态分布，95%置信水平），则纯度的标准不确定度u(P)=0.5%/1.96≈0.255%。

需注意：A类与B类评估的结果在数学上是等价的——都是标准偏差的估计值，因此合成时无需区分类型，直接代入公式即可。

合成标准不确定度的计算

合成标准不确定度（uc）是所有输入量的标准不确定度对评估目标的综合影响，计算核心是“灵敏度系数”与“方和根法”。灵敏度系数（ci）表示输入量xi的变化对评估目标w的影响程度，计算公式为ci=∂w/∂xi（数学模型对xi的偏导数）。

以常用的外标法模型为例：w = (A样×C标×V×D)/(A标×m×1000)，各输入量的灵敏度系数：

- 对A样（样品峰面积）：ci1=w/A样（因为w=A样×...，所以偏导是.../A标×m×1000，即w/A样）；

- 对C标（对照品浓度）：ci2=w/C标；

- 对V（定容体积）：ci3=w/V；

- 对D（稀释倍数）：ci4=w/D；

- 对A标（对照品峰面积）：ci5=-w/A标；

- 对m（称样量）：ci6=-w/m；

由于各输入量独立（如A样与C标无关，V与m无关），合成标准不确定度的计算公式为：uc²(w) = (ci1×u(A样))² + (ci2×u(C标))² + (ci3×u(V))² + (ci4×u(D))² + (ci5×u(A标))² + (ci6×u(m))²。

为简化计算，通常将公式转换为“相对标准不确定度”形式——相对标准不确定度ur(xi)=u(xi)/xi，相对合成标准不确定度ur(w)=uc(w)/w，则上式可简化为：ur²(w) = ur²(A样) + ur²(C标) + ur²(V) + ur²(D) + ur²(A标) + ur²(m)。这种方法更直观，尤其适用于乘法/除法模型。

例如，外标法测定杂质A，w=0.20%，各输入量的相对标准不确定度：ur(A样)=0.6%，ur(C标)=0.4%，ur(V)=0.2%，ur(D)=0.1%，ur(A标)=0.5%，ur(m)=0.1%，则ur(w)=√(0.6%²+0.4%²+0.2%²+0.1%²+0.5%²+0.1%²)=√0.83×10⁻²≈0.00911，因此uc(w)=0.20%×0.00911≈0.0018%。

需注意：若输入量之间存在相关性（如A样与A标都来自同一台液相色谱仪，受同一检测器误差影响），则需计入协方差项cov(xi,xj)，公式变为uc²(w)=Σ(ci×u(xi))² + 2Σ(ci×cj×cov(xi,xj))。但在大多数原料药杂质分析中，输入量之间的相关性可忽略，因此可简化为方和根法。

计算扩展不确定度与结果报告

扩展不确定度（U）是“用户友好”的不确定度形式——它将合成标准不确定度扩大到一定置信水平，便于非专业人员理解结果的可靠性。ICH Q2（R1）推荐默认使用k=2（对应95%置信水平），因为这是最常用的置信水平，且适用于大多数正态分布或近似正态分布的情况。

计算公式为：U = k×uc(w)。例如，上述外标法例子中，uc(w)=0.0018%，k=2，则U=0.0036%。需注意：扩展不确定度的有效数字不应超过2位（如0.0036%应简化为0.004%或0.003%），且结果的小数位数应与扩展不确定度匹配（如w=0.20%，U=0.004%，则报告为0.20±0.004%）。

结果报告需包含以下信息：（1）评估目标：如“原料药中杂质A的质量分数”；（2）结果值：如“0.20%”；（3）扩展不确定度：如“U=0.004%”；（4）置信水平与包含因子：如“置信水平95%，k=2”；（5）评估方法：如“依据ICH Q2（R1）和USP <41>”。

例如，完整报告为：“原料药中杂质A的质量分数w=0.20%，扩展不确定度U=0.004%（置信水平95%，k=2），评估依据ICH Q2（R1）和USP <41>。”

需避免的错误：（1）不确定度的有效数字过多（如U=0.00362%）；（2）结果与不确定度的小数位数不匹配（如w=0.2%，U=0.004%）；（3）未说明置信水平与包含因子（如仅报告U=0.004%）。

特殊来源的不确定度处理：回收率与重复性

在原料药杂质分析中，“回收率”与“重复性”是两个常见且重要的不确定度来源，需特别处理。

回收率（Recovery）是指“加标样品的测得量与加标量的比值”，反映方法的准确性。若回收率R≠100%，需在数学模型中加入校正因子（如w = 测得值/R），此时回收率的不确定度u(R)需计入合成不确定度。回收率的标准不确定度通常通过回收率试验的统计分析获得：例如，对加标量为0.1%的样品进行6次回收率试验，结果为97%、98%、99%、98%、97%、98%，平均值R̄=98%，样本标准差s(R)=0.816%，则标准不确定度u(R)=s(R)/√n=0.816%/√6≈0.333%，相对标准不确定度ur(R)=u(R)/R̄=0.333%/98%≈0.340%。

重复性（Repeatability）是指“同一分析员在同一仪器上，短时间内对同一样品进行多次测定的变异”，其标准不确定度u(repeat)通常通过重复性试验的样本标准差计算：例如，对某样品进行6次平行测定，结果为0.19%、0.20%、0.21%、0.20%、0.19%、0.20%，样本标准差s=0.0082%，则u(repeat)=s/√n=0.0082%/√6≈0.0033%。需注意：若数学模型中已包含重复性（如A类评估中的重复性），则无需重复计算。

中间精密度（Intermediate Precision）是指“不同分析员、不同仪器、不同日期对同一样品进行测定的变异”，其标准不确定度u(IP)通常通过中间精密度试验的方差分析（ANOVA）计算。例如，2个分析员、2台仪器、3天的试验，共12个数据，方差分析得中间精密度的标准差s(IP)=0.010%，则u(IP)=s(IP)/√n=0.010%/√12≈0.0029%（n为总测定次数）。

需注意：重复性与中间精密度的区别在于“变异来源的广度”——重复性是短期的、小范围的变异，中间精密度是长期的、大范围的变异。若评估的是“方法的不确定度”（如方法验证中的不确定度），应使用中间精密度；若评估的是“单次测定的不确定度”（如日常检验中的结果），应使用重复性。

面积归一化法的不确定度评估要点

面积归一化法是原料药杂质分析中最常用的方法之一，其原理是“杂质峰面积占总峰面积的百分比”，数学模型为w = (A杂/A总)×100%，其中A总=A主+ΣA杂（A主为主成分峰面积，ΣA杂为所有杂质峰面积之和）。

面积归一化法的不确定度来源主要有：（1）峰面积积分的准确性：积分参数（如斜率灵敏度、峰宽、阈值）的设置会影响峰面积的计算，例如，将斜率灵敏度从10提高到20，可能导致杂质峰面积减少5%；（2）峰分离度：若杂质峰与相邻峰的分离度R<1.5，未分离峰的面积会被计入杂质峰或主成分峰，导致结果误差；（3）仪器的线性范围：若杂质浓度超过检测器的线性范围，峰面积与浓度的线性关系会偏离，导致结果误差；（4）主成分的响应因子：若主成分与杂质的响应因子差异较大（如>10%），面积归一化法的结果会偏差，需用校正面积归一化法（如加入响应因子校正）。

量化峰面积积分的不确定度：可通过“改变积分参数试验”计算——设置不同的积分参数（如斜率灵敏度5、10、15、20，峰宽0.1、0.2、0.3min），测定杂质峰面积，计算峰面积的标准偏差s(A杂)，则标准不确定度u(A杂)=s(A杂)/√n（n为试验次数）。例如，5次不同积分参数的试验，A杂分别为1000、1050、980、1020、1010，平均值Ā杂=1012，s(A杂)=√[(