原料药中多肽类杂质分析的液相色谱-串联质谱定量方法

原料药中的多肽类杂质因结构相似、含量极低且易干扰主成分测定，成为质量控制的难点。液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）凭借高分离能力与高灵敏度，成为多肽类杂质定量分析的核心技术。本文围绕方法开发中的样品前处理、色谱分离优化、质谱参数选择及方法验证等关键环节，结合实际案例拆解LC-MS/MS在多肽类杂质分析中的具体应用，为原料药质量控制提供可操作的技术参考。

样品前处理：多肽类杂质的溶解性与稳定性控制

多肽类杂质的分子结构含多个氨基和羧基，极性较强，通常需用含水溶剂（如0.1%甲酸水溶液、5%乙腈水溶液）溶解，但部分疏水性多肽杂质易在高有机相比例下沉淀，需通过预实验确定最佳溶剂体系。例如，分析某生长激素原料药中的脱酰胺杂质时，若直接用纯乙腈溶解，会导致杂质析出，而采用0.1%甲酸-乙腈（90:10）混合溶剂可完全溶解样品。

多肽易受温度、pH影响发生降解，前处理需在4℃冰浴下进行，且避免强酸强碱条件——如处理含二硫键的多肽杂质时，若pH>8会导致二硫键断裂，需将样品pH调至5-7的中性范围。另外，样品中的蛋白质类基质可能吸附多肽杂质，需通过离心（12000rpm，10min）或超滤（分子截流量10kDa）去除大分子干扰，确保杂质完全释放。

对于低含量杂质（如<0.1%），需采用固相萃取（SPE）富集：例如某胰岛素原料药中的氧化杂质，用C18 SPE柱富集后，杂质浓度可提高10-20倍，满足质谱检测下限要求。SPE柱的选择需匹配杂质的极性——极性杂质选亲水亲脂平衡柱（HLB），疏水性杂质选C18柱，确保富集效率。

前处理的最后一步需过滤（0.22μm尼龙滤膜），去除颗粒物，避免堵塞色谱柱或污染质谱离子源。若样品中含缓冲盐（如磷酸盐），需用脱盐柱（如ZipTip）处理，否则高浓度盐会抑制ESI离子化，导致质谱响应下降。

色谱分离优化：色谱柱与流动相的适配性设计

多肽类杂质与主成分的结构差异通常仅在于1-2个氨基酸残基或修饰（如脱酰胺、氧化），色谱分离需最大化保留差异。常用的反相色谱柱中，C18柱对疏水性多肽保留强，但对极性较强的多肽杂质（如N端乙酰化杂质）保留不足，此时可选择C8柱（碳链更短，极性化合物保留增强）或苯基柱（π-π相互作用改善芳香族氨基酸杂质的分离）。例如，分离某GLP-1类似物中的Trp氧化杂质（含吲哚环），苯基柱的分离度较C18柱高2倍。

流动相方面，0.1%甲酸是最常用的酸性添加剂，可质子化多肽的氨基基团，增强离子化效率；若峰形拖尾严重，可替换为0.1%乙酸（酸性更弱，减少硅胶基质的吸附）；但三氟乙酸（TFA）虽能改善峰形，却会抑制电喷雾离子源（ESI）的离子化，导致质谱响应下降，因此仅在峰形极差时小比例使用（如0.02% TFA）。

梯度洗脱的起始有机相比例需足够低（如5%乙腈），确保极性杂质完全保留在色谱柱上，然后以0.5-1%/min的速率线性升高至95%乙腈，使杂质与主成分逐一洗脱——例如某胰岛素原料药中的A21-Asp杂质（极性较强），起始5%乙腈可避免其“死体积峰”，梯度速率0.8%/min时分离度达到1.5以上，满足定量要求。

柱温也会影响分离效果：多肽类杂质的保留随温度升高而降低，通常选择30-40℃——温度过高（如50℃）会导致多肽降解，温度过低（如20℃）会延长保留时间，增加分析周期。例如，某多肽杂质的保留时间从15min缩短至10min，仅需将柱温从30℃升至40℃，且峰形无变化。

质谱参数：离子源与特征离子对的确定

多肽类杂质的极性强，电喷雾离子源（ESI）是首选——ESI能将多肽分子质子化形成多电荷离子（如[M+2H]²+、[M+3H]³+），提高质谱响应。相比之下，大气压化学电离源（APCI）更适合低极性化合物，对多肽的离子化效率低，一般不采用。

母离子选择时，需通过全扫描（Full Scan）模式观察多肽的电荷状态，选择响应最高的多电荷离子作为母离子——例如某多肽杂质（分子量1500Da）的[M+2H]²+（m/z 750.5）响应是[M+3H]³+（m/z 500.3）的3倍，因此选择前者作为母离子。母离子的质荷比需精确到小数点后一位，确保后续子离子扫描的准确性。

子离子需通过产物离子扫描（Product Ion Scan）确定特征碎片：多肽的肽键断裂会产生b离子（N端碎片）和y离子（C端碎片），优先选择强度高且专属的碎片离子——例如某Lys残基的多肽杂质，y4离子（含Lys的C端碎片，m/z 456.2）的响应是b3离子（m/z 289.1）的5倍，且无干扰，因此确定为子离子。

碰撞能量（CE）需针对每个离子对优化：通过注射泵连续进样（10μL/min），调整CE从10到40eV，记录子离子的响应，选择响应最高的CE值——例如上述[M+2H]²+→y4离子对，CE=25eV时响应达到最大值，若CE过高（如35eV）会导致碎片过度碎裂，响应下降。碰撞气体通常选氮气（纯度>99.99%），流量设为1.5mL/min，确保碰撞效率稳定。

基质效应：评估与针对性消除方案

原料药中的填充剂（如甘露醇）、缓冲盐（如磷酸盐）或主成分（浓度远高于杂质）会抑制或增强多肽杂质的离子化，导致定量结果偏差。评估基质效应的标准方法是“空白基质加标法”：制备空白基质溶液（不含目标杂质的原料药），加入不同浓度的杂质标准品，测定其质谱响应，与纯溶剂中的标准品响应比较，计算基质效应因子（MEF）=（加标空白基质响应/纯溶剂加标响应）×100%。

若MEF在80%-120%之间，说明基质效应可接受；若MEF<80%为抑制效应，>120%为增强效应。例如，某胰岛素原料药中的Des-Phe杂质，空白基质加标的响应仅为纯溶剂的60%（强抑制），原因是主成分胰岛素（浓度10mg/mL）与杂质竞争ESI离子源的质子，导致杂质离子化效率降低。

消除基质效应的首选方法是使用同位素内标（ISTD）：选择与目标杂质结构一致、仅含稳定同位素（如¹³C、¹⁵N）的内标，其离子化受基质影响与目标杂质一致，可通过内标归一化抵消基质效应。例如，Des-Phe杂质的¹³C₆-ISTD，加标后回收率从70%提升至95%，MEF恢复至102%。

若无法获得同位素内标，可采用样品稀释或固相萃取（SPE）：样品稀释将主成分浓度降低10倍，减少竞争离子化的机会；SPE通过富集杂质、去除主成分和基质，彻底消除基质效应。例如，某GLP-1类似物中的Met氧化杂质，经HLB SPE柱处理后，MEF从75%提升至98%，满足定量要求。

方法验证：定量可靠性的指标拆解

LC-MS/MS方法用于多肽类杂质定量时，需验证线性、回收率、精密度、检测限（LOD）及定量限（LOQ）等指标，确保结果可靠。线性范围应覆盖杂质的预期浓度（如原料药中杂质限度为0.1%，则线性范围设为0.02%-0.2%），以峰面积比对浓度作加权最小二乘回归（权重1/x²），减少低浓度点的误差，相关系数r需≥0.99。

回收率需在低（LOQ的2倍）、中（限度浓度）、高（限度的2倍）三个浓度水平进行，每个水平平行3份，回收率需在80%-120%之间。例如，某生长激素中的脱酰胺杂质，低浓度（0.02%）回收率92%，中浓度（0.1%）95%，高浓度（0.2%）98%，符合ICH Q2(R1)要求。

精密度包括日内精密度（同一日内6次测定）和日间精密度（连续3天测定），相对标准偏差（RSD）需<10%。例如，某胰岛素杂质的日内精密度RSD=3.2%，日间精密度RSD=5.1%，说明方法重复性好。

LOD是信噪比（S/N）=3时的浓度，LOQ是S/N=10时的浓度，且LOQ需低于杂质限度的50%（如限度0.1%，LOQ≤0.05%）。例如，某多肽杂质的LOD=0.005%，LOQ=0.015%，远低于限度要求，确保能检测到低含量杂质。

实际案例：某长效胰岛素类似物的杂质分析

某长效胰岛素类似物原料药（规格10mg/mL）需检测A21-Asp（脱酰胺）、Des-Thr（N端缺失Thr）及Met-oxide（Met氧化）三个已知杂质，质量标准要求单个杂质≤0.1%，总杂质≤0.3%。

样品前处理：取1mL原料药溶液，加入4mL 0.1%甲酸-乙腈（90:10）混合溶剂，涡旋1min，12000rpm离心10min，取上清液经0.22μm滤膜过滤，进样量10μL。

色谱条件：苯基柱（2.1×150mm，3μm），柱温30℃，流动相A为0.1%甲酸水溶液，流动相B为0.1%甲酸乙腈溶液，梯度洗脱：0-5min 5%B（保持极性杂质保留），5-20min 5%-35%B（线性升高分离杂质），20-25min 35%-95%B（冲洗色谱柱），流速0.3mL/min。此条件下，三个杂质的分离度均>1.5，主成分与杂质峰无重叠。

质谱条件：ESI+离子源，喷雾电压5500V，鞘气35psi，辅助气10psi，离子传输管温度320℃。各杂质的离子对与碰撞能量：A21-Asp [M+2H]²+→y4（m/z 812.4→456.2，CE=22eV），Des-Thr [M+2H]²+→b3（m/z 798.3→289.1，CE=20eV），Met-oxide [M+2H]²+→y5（m/z 826.5→512.3，CE=25eV）。同位素内标选用¹³C标记的长效胰岛素类似物，浓度与杂质限度一致。

方法验证结果：线性范围0.01-0.5μg/mL（r≥0.997），回收率90%-96%，精密度RSD<5%，LOQ=0.015%。实际样品分析：三个杂质的含量分别为A21-Asp 0.08%、Des-Thr 0.05%、Met-oxide 0.03%，总杂质0.16%，均符合质量标准。

常见问题及解决方案：从峰形到灵敏度的调试

峰形拖尾是多肽杂质分析中最常见的问题，多因多肽与色谱柱的硅胶基质发生氢键吸附。解决方案：1）更换色谱柱——用硅胶表面键合更完全的“封端柱”（End-capped），减少未键合硅羟基的吸附；2）调整流动相pH——用0.1%乙酸代替甲酸，降低硅胶的解离度；3）增加流动相中的有机相比例——起始有机相从5%增至10%，减少极性杂质的吸附。例如，某多肽杂质的拖尾因子从1.8降至1.2，仅需更换为封端C8柱。

灵敏度不足表现为质谱响应低（峰面积小），原因可能是离子化效率低或质谱参数未优化。解决方案：1）提高离子源温度——ESI源的离子传输管温度从300℃升至350℃，增强溶剂蒸发，减少簇离子形成；2）调整喷雾气流量——鞘气从30psi增至35psi，改善液滴雾化效果；3）优化碰撞能量——通过注射泵进样，找到响应最高的CE值。例如，某杂质的质谱响应从1e5增至5e5，仅需将CE从20eV调至25eV。

质谱信号漂移（日内响应变化>10%）多因离子源污染或流动相组成变化。解决方案：1）定期清洗离子源——每周用50%甲醇冲洗离子源锥孔，去除残留的蛋白质或盐；2）使用新鲜配制的流动相——甲酸易挥发，流动相放置超过24h会导致pH变化，影响离子化；3）稳定质谱状态——开机后预热30min，待离子源温度、鞘气流量稳定后再进样。

假阳性结果（检测到不存在的杂质）多因质谱干扰，例如流动相中的污染物或其他杂质的碎片离子。解决方案：1）做空白对照（流动相进样），确认干扰峰的来源；2）优化子离子选择——选择更专属的子离子（如含独特氨基酸的碎片，如Trp的吲哚环碎片）；3）提高色谱分离度——通过调整梯度洗脱条件，使干扰峰与目标杂质峰分开。例如，某假阳性峰经空白对照确认是流动相中的塑化剂（邻苯二甲酸酯），更换流动相后干扰消失。