生物及化学环境试验中微生物检测的标准操作流程

在生物及化学环境试验中，微生物检测是评估环境介质（水、土壤、空气等）污染水平、识别致病微生物风险的核心环节，其结果直接支撑环境质量评价与污染治理决策。而标准操作流程（SOP）是确保检测准确性的关键——从样品采集到结果输出的每一步都需严格规范，避免操作差异导致的误差。本文结合GB/T 4789系列、HJ 1000-2018等国家标准，详细拆解微生物检测的全流程要点。

样品采集：代表性与无菌性的双重保障

样品采集是微生物检测的基础，核心原则是“代表性”与“无菌性”。代表性要求覆盖检测目标的空间分布：土壤样品需采集0-20cm表层、20-40cm中层及40-60cm深层，每个层次取3-5个点混合成复合样；空气样品用安德森采样器采集不同高度（1.2m人体呼吸带、0.5m地面附近）的空气，确保覆盖环境微生物的分布。无菌性则需所有接触样品的工具（采样勺、容器、吸管）经121℃高压蒸汽灭菌30分钟，或使用一次性无菌耗材——比如采集水样时，需用无菌玻璃瓶在水面下10-20cm处接取，避免表层漂浮物污染。

不同介质的采样细节需调整：自来水采样前需放水3-5分钟，去除管道内残留的消毒剂；含悬浮物的工业废水需摇匀后采集，或用0.45μm无菌滤膜现场过滤浓缩；土壤样品采集后需装入无菌自封袋，4℃冷藏保存不超过24小时，避免微生物繁殖或死亡。采样完成后需立即标注样品编号、来源及采样时间，防止混淆。

样品预处理：消除干扰与富集目标菌

环境样品常含颗粒物、化学抑制剂（如消毒剂、重金属），需通过预处理消除干扰。固体样品（土壤、污泥）需制成匀浆：称取10g样品加入90mL无菌生理盐水，用均质器（8000rpm）处理1-2分钟，制成1:10的稀释液；若样品含大量有机物（如堆肥），需用缓冲蛋白胨水替代生理盐水，避免渗透压变化损伤微生物。

液体样品需稀释或过滤：澄清水样做10倍梯度稀释（1mL样品加9mL生理盐水），选择菌落数在30-300cfu的稀释倍数；悬浮物多的水样用0.45μm滤膜过滤，将滤膜转移至琼脂平板培养。含化学抑制剂的样品需中和：比如含氯废水加0.1%硫代硫酸钠，含季铵盐的消毒液加0.1%卵磷脂+0.5%吐温80，中和残留的杀菌成分。预处理后的样品需在2小时内接种，避免微生物活性下降。

培养基制备：选择与质量控制

培养基需匹配检测目标：总菌落数（TVC）用营养琼脂（NA），大肠菌群用月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST）肉汤，金黄色葡萄球菌用甘露醇高盐琼脂（MSA）。配制时严格按说明书称量——比如1L营养琼脂需称取35g干粉，加入1000mL蒸馏水搅拌至溶解，调pH至7.2±0.2（用1mol/L NaOH或HCl）。

灭菌是关键步骤：普通培养基（如NA）用121℃高压蒸汽灭菌15分钟；含糖培养基（如MSA）需115℃灭菌20分钟，避免糖焦化；热敏性培养基（如MUG）用0.22μm滤膜过滤除菌。灭菌后需检查质量：液体培养基需澄清无沉淀，固体培养基冷却后需均匀凝固；取10mL培养基倒入平板，37℃培养24小时无菌落，说明无菌合格。

接种与培养：方法与条件匹配

接种方法需根据样品类型选择：液体样品用涂布法——取0.1mL稀释液，用无菌涂布棒均匀涂抹在平板表面（涂布棒需灼烧冷却后使用）；固体稀释样品用倾注法——取1mL稀释液加入平板，再倒入45-50℃的熔化琼脂，快速旋转混合；需分离单菌落时用划线法——接种环取少量样品，在平板上做“Z”字划线，每划一次灼烧接种环，确保菌落分离。

培养条件需贴合微生物特性：一般细菌（如大肠菌群）在37℃培养18-24小时；嗜冷菌（如假单胞菌）需25℃培养48小时；厌氧菌（如破伤风梭菌）需用厌氧罐（加入厌氧产气袋），37℃培养72小时。培养时平板需倒置，防止冷凝水冲散菌落；培养箱湿度控制在70%-80%，避免琼脂干裂。

菌落计数与鉴定：从数量到种类的精准判断

菌落计数需遵循GB/T 4789.2-2016规则：选择30-300cfu的平板，超过300cfu说明稀释倍数过低，低于30cfu则结果不可靠。比如1:100稀释的平板有150个菌落，结果为150×100=15000cfu/g。蔓延生长的菌落需排除，避免影响计数准确性。

鉴定需结合多维度信息：形态学观察（菌落大小、颜色、边缘）——大肠菌群在EMB琼脂上呈紫黑色带金属光泽；染色试验（革兰氏染色）——阳性菌呈紫色，阴性菌呈红色；生化试验（氧化酶试验）——假单胞菌10秒内变蓝，肠杆菌科呈阴性；分子方法（16S rRNA测序）——提取菌株DNA，扩增后与GenBank数据库比对，相似度≥97%可判定种属。

结果记录与验证：数据的可追溯性

结果记录需覆盖全流程：样品信息（编号、来源、采样时间）、预处理步骤（稀释倍数、中和剂）、培养基信息（名称、批号）、接种方法、培养条件、菌落计数结果、鉴定结论。记录需用钢笔或电子文档，涂改处需签字确认。原始数据（平板照片、PCR电泳图、测序报告）需备份保存5年以上，确保可追溯。

验证是确保准确性的关键：平行样相对偏差需≤10%（如样品A的平行样结果为1200cfu/mL和1300cfu/mL，偏差8%符合要求）；回收率试验需加标（如加100cfu大肠杆菌），回收率在70%-110%之间；阳性对照（接种标准菌株）需生长正常，阴性对照（接种无菌水）需无菌落，避免污染或操作错误。

异常情况处理：快速排查与纠正

若平板无菌落，需先检查阳性对照——阳性对照生长正常说明样品中微生物浓度低，需增加采样量或降低稀释倍数；阳性对照不生长则可能是培养基失效，需重新配制。若出现异常菌落（如粘液状、颜色怪异），需检查培养基灭菌情况——若培养基污染，需重新制备；若异常菌落是目标菌（如铜绿假单胞菌的绿色菌落），需用生化试验确认。

若结果超出标准限值（如生活饮用水大肠菌群＞3cfu/100mL），需立即复检：重新采集同地点样品，用相同方法检测；若复检仍超标，需排查污染来源（水源、采样过程、实验室），并保留所有复检数据，为后续调查提供依据。