水质检测单位对生活饮用水中微生物指标的常规检测方法

菌落总数检测：衡量水质微生物污染的基础指标

菌落总数是生活饮用水微生物检测中最基础的指标，反映水样中可在营养琼脂上生长的活菌总数，主要用于指示水质的微生物污染程度与清洁状况。常规检测采用GB 4789.2-2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验 菌落总数测定》中的平板计数法，这是水质检测单位最常用的经典技术。

操作时，首先需对水样进行梯度稀释：将采集的水样摇匀后，用无菌吸管吸取1mL水样注入9mL无菌生理盐水中，制成1:10稀释液，依次类推制备1:100、1:1000等稀释度。稀释的核心是让最终接种到平板上的菌液浓度处于30-300CFU/平板的计数范围内——若稀释度过高，平板上菌落数过少会导致结果偏差；若稀释度过低，菌落重叠则无法准确计数。

接下来是接种与培养：取不同稀释度的菌液各1mL，分别注入无菌平皿，再倒入约15mL融化并冷却至46℃的营养琼脂培养基，快速摇匀使菌液与培养基混合均匀（倾注法）；或先倒培养基待凝固后，用无菌涂布器将菌液均匀涂在平板表面（涂布法）。待培养基凝固后，将平皿倒置放入36±1℃恒温培养箱，培养48±2小时。

计数时，需选择菌落数在30-300之间的平板，计算平均值后乘以稀释倍数，得到每毫升水样中的菌落总数（CFU/mL）。若所有稀释度平板的菌落数都超过300，则取最高稀释度的平均菌落数乘以稀释倍数；若都低于30，则取最低稀释度的结果并注明“小于X CFU/mL”。需要注意的是，平板上的蔓延菌落或针尖状微小菌落需排除，避免干扰计数准确性。

菌落总数的结果解读需结合标准：GB 5749-2022规定生活饮用水中菌落总数≤100CFU/mL。若结果超标，通常提示水样可能受到了二次污染（如输水管网破损、储水设施清洁不当），需进一步排查污染源。

总大肠菌群检测：指示粪便污染的经典方法

总大肠菌群是一群能在36℃下24小时内发酵乳糖产酸产气、需氧或兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌，是粪便污染的重要指示菌——其存在意味着水样可能含有来自人类或动物粪便的病原体（如沙门氏菌、志贺氏菌）。水质检测单位常用的常规方法有多管发酵法和滤膜法。

多管发酵法是“三步法”：第一步初发酵，将水样接种到乳糖胆盐发酵管（每管10mL、1mL或0.1mL水样，对应不同稀释度），36±1℃培养24±2小时。若发酵管内出现气泡（产气），且培养基由紫色变为黄色（产酸），则为初发酵阳性，提示可能存在总大肠菌群。第二步复发酵，从初发酵阳性管中取1环菌液，接种到伊红美蓝琼脂（EMB）平板上，36℃培养18-24小时。EMB平板上的总大肠菌群典型菌落为紫黑色、有金属光泽，或粉红色、湿润粘稠。第三步确认试验，挑取3个典型菌落，分别接种到乳糖发酵管中，36℃培养24小时，若产气则最终确认总大肠菌群阳性。

滤膜法更适合处理杂质较少的水样（如出厂水）：将一定体积的水样通过0.45μm无菌滤膜过滤，使微生物截留在滤膜表面，然后将滤膜正面向上贴在含有乳糖的选择性培养基（如远藤氏琼脂）上，36℃培养24小时。滤膜上出现的典型菌落（如带金属光泽的红色菌落）即为总大肠菌群，计数后计算每100mL水样中的菌落数。滤膜法的优势是操作更快捷，且能直接观察菌落形态，但需注意滤膜的无菌性——过滤前需用无菌水冲洗滤器，避免外来污染。

总大肠菌群的标准限值为“不得检出”（GB 5749-2022），因此即使检测到1个阳性结果，也需判定水样不符合标准。检测过程中需设置阴性对照（无菌水）和阳性对照（大肠埃希氏菌标准菌株），确保试验体系的有效性。

大肠埃希氏菌检测：精准定位粪便污染来源

总大肠菌群虽能指示粪便污染，但部分菌株可能来自土壤或植物，而大肠埃希氏菌（E.coli）是人类和温血动物肠道内的正常菌群，其存在更能精准反映近期的粪便污染。GB 5749-2022规定生活饮用水中大肠埃希氏菌“不得检出”，因此检测单位需采用特异性更强的方法。

酶底物法是目前最常用的常规方法之一，原理是大肠埃希氏菌能产生β-葡萄糖醛酸酶（GUS），可分解培养基中的4-甲基伞形酮-β-D-葡萄糖醛酸苷（MUG），释放出荧光物质4-甲基伞形酮（4-MU）。操作时，取100mL水样加入含有乳糖和MUG的无菌培养基瓶中，充分混匀后放入36±1℃恒温培养箱，培养24±2小时。

结果判断分为两步：首先观察培养基是否产气（乳糖发酵产酸产气），若产气则为总大肠菌群阳性；其次在紫外线灯（波长366nm）下观察培养基是否发出蓝色荧光，若荧光阳性则提示存在大肠埃希氏菌。需注意的是，部分非大肠埃希氏菌的菌株（如某些克雷伯氏菌）也可能产生GUS，因此荧光阳性后需做确认试验——挑取菌液接种到EC肉汤中，44.5℃培养24小时，若产气且靛基质试验阳性（大肠埃希氏菌能分解色氨酸产生靛基质，加入对二甲氨基苯甲醛后呈红色），则最终确认大肠埃希氏菌阳性。

酶底物法的优势是一体化操作（无需转种）、灵敏度高（能检测到1CFU/100mL），但需注意培养基的保存条件——MUG对光敏感，需避光冷藏保存，避免荧光物质提前分解影响结果。此外，检测过程中需避免紫外线直接照射皮肤和眼睛，做好防护措施。

耐热大肠菌群检测：评估水体热稳定性污染的指标

耐热大肠菌群（又称粪大肠菌群）是总大肠菌群中能在44.5℃高温下生长繁殖的亚群，主要来自人类和动物的新鲜粪便，因此更能指示近期的粪便污染（如管网泄漏导致的污水混入）。GB 5749-2022规定生活饮用水中耐热大肠菌群“不得检出”，检测方法以多管发酵法和滤膜法为主。

多管发酵法使用EC肉汤（胰蛋白胨、乳糖、胆盐等成分）作为培养基，因为EC肉汤能抑制非耐热性大肠菌群的生长。操作时，从总大肠菌群初发酵阳性管中取1环菌液，接种到EC肉汤管中，然后将肉汤管放入44.5±0.5℃的恒温水浴箱（或隔水式培养箱）中，培养24±2小时。若肉汤管产气，则为耐热大肠菌群阳性。需特别注意温度控制：44.5℃是耐热大肠菌群的选择性生长温度，若温度低于44℃，非耐热菌株可能生长；若高于45℃，则会抑制耐热菌株生长，导致假阴性结果。

滤膜法使用M-TEC琼脂（含有胰蛋白胨、乳糖、溴甲酚紫等），培养温度同样为44.5℃。将水样过滤后，滤膜贴在M-TEC琼脂平板上，培养24小时后，耐热大肠菌群的典型菌落为黄色（因发酵乳糖产酸，使溴甲酚紫由紫色变为黄色）。计数后计算每100mL水样中的菌落数。滤膜法的优点是能直接观察菌落形态，减少假阳性，但需确保滤膜与培养基紧密接触，避免空气气泡影响微生物生长。

耐热大肠菌群的检测需与总大肠菌群结合分析：若总大肠菌群阳性但耐热大肠菌群阴性，可能是土壤或植物来源的污染；若两者均阳性，则提示存在新鲜粪便污染，需立即采取措施（如停止供水、排查管网）。

隐孢子虫与贾第鞭毛虫检测：应对原虫类微生物的特殊方法

隐孢子虫（Cryptosporidium）和贾第鞭毛虫（Giardia）是生活饮用水中常见的原虫类病原体，能引起腹泻、呕吐等肠道疾病，且对氯消毒有较强抵抗力。GB 5749-2022规定两者的限值均为“≤1个/10L”，检测单位需采用免疫磁分离-荧光抗体法（IMS-IFA），这是国际上通用的常规方法。

第一步是水样浓缩：由于原虫在水中的浓度极低（通常每升水中只有几个），需先浓缩水样。常用的浓缩方法有离心法（将10L水样在3000rpm下离心15分钟，收集沉淀物）和过滤法（用1μm孔径的聚醚砜滤膜过滤水样，然后用洗脱液将滤膜上的原虫洗脱下来）。浓缩的关键是提高回收率——离心时需加入絮凝剂（如硫酸铝），使原虫颗粒凝聚；过滤时需控制流速（≤1L/min），避免原虫穿过滤膜。

第二步是免疫磁分离（IMS）：将浓缩后的样品与包被有隐孢子虫或贾第鞭毛虫特异性抗体的磁珠混合，室温孵育15分钟。抗体与原虫表面的抗原结合，使原虫吸附在磁珠上。然后将样品放入磁场中（如磁分离架），静置5分钟，弃去上清液，用洗涤液冲洗磁珠3次，去除未结合的杂质。IMS的作用是富集原虫，同时去除水样中的干扰物质（如泥沙、有机物），提高后续检测的灵敏度。

第三步是荧光抗体染色（IFA）：将磁珠悬浮液涂在载玻片上，自然干燥后用甲醇固定。然后加入荧光素（FITC）标记的特异性抗体（抗隐孢子虫或抗贾第鞭毛虫），37℃孵育30分钟，用PBS缓冲液冲洗3次，最后用抗淬灭剂封片。

第四步是镜检：用荧光显微镜（激发波长488nm，发射波长525nm）观察载玻片，隐孢子虫的卵囊呈圆形，直径4-6μm，发出绿色荧光；贾第鞭毛虫的包囊呈椭圆形，直径8-12μm，同样发出绿色荧光。为确保结果准确，需同时观察细胞核（用DAPI染色，呈蓝色）——隐孢子虫卵囊内有4个孢子囊，贾第鞭毛虫包囊内有2个细胞核。镜检时需计数至少200个视野，若发现疑似颗粒，需用 differential interference contrast（DIC）显微镜确认形态。

IMS-IFA法的回收率需达到50%以上（通过添加标准原虫卵囊/包囊验证），否则需调整浓缩或分离步骤。由于操作复杂，检测单位需定期对人员进行培训，确保每一步的规范性——比如磁珠与抗体的比例、孵育时间、洗涤次数等，都会影响最终结果。

快速检测方法：弥补传统培养法的时效性不足

传统培养法（如多管发酵法、平板计数法）虽准确，但需24-48小时才能出结果，无法满足应急检测（如突发水污染事件）的需求。因此，水质检测单位会配备一些快速检测方法，作为传统方法的补充。

荧光定量PCR（qPCR）是最常用的快速检测技术之一，原理是通过扩增微生物的特异性基因片段（如大肠埃希氏菌的uidA基因，隐孢子虫的18S rRNA基因），并利用荧光染料（如SYBR Green）或荧光探针（如TaqMan）实时监测扩增产物的累积。操作时，先从水样中提取微生物DNA，然后将DNA加入含有引物、荧光染料和PCR酶的反应体系中，在PCR仪上进行扩增（通常需要1-2小时）。结果通过荧光曲线判定：若曲线出现明显的指数增长期，则为阳性；根据标准曲线可计算出初始模板的浓度（即微生物数量）。qPCR的优势是快速、灵敏（能检测到1CFU/mL），但需注意避免交叉污染——PCR试剂需在无菌环境中配制，样品处理区与扩增区严格分开，避免扩增产物污染样品。

免疫层析法（胶体金试纸条）是另一种快速方法，原理是利用抗原抗体的特异性结合：试纸条上的检测线包被有微生物特异性抗体，胶体金颗粒标记有另一抗体。当水样中的微生物流过试纸条时，先与胶体金标记抗体结合，形成抗原-抗体-胶体金复合物，然后与检测线的抗体结合，形成红色条带。若检测线出现红色，则为阳性；若仅质控线出现红色，则为阴性。免疫层析法的操作非常简单（只需将试纸条浸入水样中），15-30分钟即可出结果，适合现场快速筛查（如管网末梢水的日常巡检）。但该方法是定性或半定量检测，不能替代传统方法做确认——若试纸条阳性，需用培养法或PCR法进一步验证。

快速检测方法的应用场景主要是应急响应（如疑似污染事件）或日常筛查（如大量水样的初筛），但需注意：快速方法的结果需经过传统方法的验证，才能作为执法依据（因为GB 5749-2022规定的仲裁方法是传统培养法）。

质量控制：确保检测结果可靠性的关键环节

无论采用哪种检测方法，质量控制都是水质检测单位的核心工作——只有通过严格的质控，才能保证结果的准确性和可比性，为供水安全决策提供可靠依据。

室内质控（IQC）是日常检测中的基础：首先是空白试验，每次检测需同时做空白对照（用无菌水代替水样），若空白试验阳性，说明试剂、耗材或操作过程中存在污染，需重新检测。其次是阳性对照，用标准菌株（如大肠埃希氏菌ATCC25922、隐孢子虫标准卵囊）做接种，若阳性对照阴性，说明方法或试剂失效，需更换试剂并重新校准仪器。第三是平行样试验，同一水样做2-3个平行样，结果的相对偏差需≤10%（菌落总数）或≤20%（原虫检测），否则需重新检测。第四是校准曲线，对于定量检测方法（如qPCR、IMS-IFA），需定期绘制校准曲线，确保标准品的浓度与检测信号的线性关系良好（R²≥0.99）。

室间质评（EQA）是验证实验室能力的重要手段：检测单位需定期参加由中国合格评定国家认可委员会（CNAS）或国家卫生健康委员会组织的能力验证计划（如“生活饮用水中微生物指标检测”）。能力验证的过程是：组织者向实验室发送盲样（已知浓度的水样），实验室按常规方法检测并上报结果，组织者将结果与参考值对比，评价实验室的检测能力。若结果在可接受范围内（如Z值≤2），说明实验室的方法和人员操作符合要求；若结果超出范围，需分析原因（如试剂过期、人员操作失误）并采取纠正措施。

人员培训也是质量控制的重要部分：微生物检测是一项技术性很强的工作，人员的操作技能直接影响结果的准确性。检测单位需定期组织培训（如GB 5749-2022标准解读、新方法操作培训），并进行考核（如盲样测试、操作技能比拼）。此外，人员需熟悉实验室安全规范——微生物检测中会接触到致病菌（如沙门氏菌），需戴手套、口罩，操作后及时消毒工作台，避免实验室感染。